Annexin V-AF647/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒

15分钟快速染色分群清晰易调补偿

应用：

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宿主种属：

产品名称：Annexin V-AF647/7-AAD细胞凋亡检测试剂盒货号：100-103 规格：100t 目录价：¥2,000.00 品牌：GOONIE 厂家：信天翁生物科技（广州）有限公司官网产品链接：www.gooniebio.cn/products/goonie/annexin-v-af6477-aad-cell-apoptosis-assay-kit-100-103.html

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产品描述
组成成分
注意事项

货号规格
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100-103-30 30 次
100-103-60 60 次
100-103-100 100 次

产品简介
本试剂盒用于细胞凋亡的快速检测。在细胞凋亡早期，质膜内侧的磷脂酰丝氨酸(phosphotidylserine,PS)会外翻至细胞膜表面；而在凋亡的中后期，一些较大分子的化合物，如7-氨基放线菌素D(7-Aminoactinomycin D,7-AAD,一种DNA结合染料) ，可进入细胞将细胞核染上红色荧光。7-AAD的发射光谱较PI窄，且发射波长更长，对其它检测通道的干扰更小，在多色荧光分析中是PI的最佳替代品。
Annexin V是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸特异性结合。本试剂盒采用荧光染料AF647标记的 Annexin V作为检测磷脂酰丝氨酸的探针，配合7-AAD ，通过使用流式细胞仪、荧光显微镜或其它荧光检测设备，可以快速检测细胞凋亡。因此将Annexin V-AF647与7-AAD进行共染，就可以区分不同凋亡时期的细胞。在双色流式细胞仪散点图上， Annexin V-AF647与7-AAD双阴性为正常细胞，Annexin V-AF647阳性、7-AAD阴性为早期凋亡细胞，Annexin V-AF647与 7-AAD双阳性为晚期凋亡细胞或坏死细胞。

保存条件
本产品冰袋运输；避光保存于2~8℃ , 保质期12个月。Annexin V-AF647和7-AAD Solution需避光保存。

检测方法
(一) 样本染色-悬浮细胞
1.    离心收集所需细胞(1500 rpm,5min)；
2.    加入预冷的PBS轻柔重悬细胞，离心收集细胞，共洗涤两次；
3.    用去离子水将10×Binding Buffer稀释至1×Binding Buffer ，再用1×Binding  Buffer重悬细胞，调整细胞浓度为1-5×106 cells/mL；
▲流式检测需设置三个对照样品来调节电压和补偿：
空白管：仅用1×Binding Buffer重悬的细胞，以评估自身荧光水平，并调整仪器电压；
单染管：分别用Annexin V-AF647或7-AAD染色，用于调节荧光通道的补偿。
4.    吸取100 μL细胞悬液(细胞总数为1-5×105 cells)至一新EP管中，加入5 μL Annexin V-AF647 ，轻柔混匀；再加入5 μL7- AAD ，轻柔混匀，室温避光孵育10~15 min；
5.    加入400 μL1×Binding Buffer ，轻柔混匀。染色后样品尽量在1 h内用流式细胞仪检测。
(一) 样本染色-贴壁细胞
1.    将细胞培养液吸出至一新离心管内，接着用预冷的PBS轻柔洗涤贴壁细胞一次。加入可以覆盖贴壁细胞的胰酶消化液，轻摇使胰酶与细胞充分接触，室温消化适当时间，轻轻吹打可以使贴壁细胞脱落下来即可；
2.    在细胞中加入上一步骤收集的细胞培养液，稍混匀，转移至离心管内，离心(1500 rpm,5min) ，弃上清；
3.    加入预冷的PBS轻柔重悬细胞，离心收集细胞，共洗涤两次；
4.    用去离子水将10×Binding Buffer稀释至1×Binding Buffer ，再用1×Binding Buffer重悬细胞，调整细胞浓度为1-5×106 cells/mL；
▲流式检测需设置三个对照样品来调节电压和补偿：
空白管：仅用1×Binding Buffer重悬的细胞，以评估自身荧光水平，并调整仪器电压；
单染管：分别用Annexin V-AF647或7-AAD染色，用于调节荧光通道的补偿。
5.    吸取100 μL细胞悬液(细胞总数为1-5×105 cells)至一新EP管中，加入5 μL Annexin V-AF647 ，轻柔混匀；再加入5 μL7- AAD ，轻柔混匀，室温避光孵育10~15 min；
6.    加入400 μL1×Binding Buffer ，轻柔混匀。染色后样品尽量在1 h内用流式细胞仪检测。

样品分析
流式细胞仪分析
AF647 最大激发波长为 651 nm，最大发射波长为665nm ；7-AAD 最大激发波长为 545nm ，最大发射波长为 650 nm，可用流式细胞仪 FL3 通道或配备 650 nm 长通滤光片的荧光显微镜检测远红荧光。

常见问题与解决方案
1. 假阳性
阴性对照(未经凋亡诱导的细胞)染色后Annexin V-AF647/7-AAD双阳性比例过高，其原因可能是细胞本身活力低，因此建议用台盼蓝染色计算细胞活力，阴性对照台盼蓝阳性的细胞比例应小于5%。若细胞活力低，建议换用其他细胞或重新复苏细胞，新复苏的细胞应传代1-2代以后进行实验。
2. Annexin V-AF647染色失败或者阳性率偏低。
首先需要确定实验中所用的凋亡诱导剂是否能产生凋亡。可通过设立阳性对照组来确定(诱导效果确定的阳性药物处理细胞) 。Annexin V-AF647染色失败，最常见的操作原因是贴壁细胞消化不当。 Annexin V跟PS的结合需要Ca2+ ， Binding Buffer中含有Ca2+ ，含EDTA的胰酶消化会影响染色。
用PBS洗涤细胞沉淀后，应尽量去除残余液体。残留PBS中的磷酸根，会形成磷酸钙沉淀。
产品组分
组分名称 100-103-30 100-103-60 100-103-100
Annexin V-AF647 150 µL 300 µL 500 µL
7-AAD Solution 150 µL 300 µL 500 µL
10×Binding Buffer 3 mL 6 mL 10 mL
注意事项
1.    Annexin V-AF647和7-AAD染色前，不能用破坏细胞膜完整性的固定剂和穿透剂固定或穿膜。
2.    整个操作过程动作要尽量轻柔，请勿用力吹打细胞，避免对细胞造成机械性损伤。
3.    对于贴壁细胞，消化过程需注意：
1)     贴壁细胞诱导细胞凋亡时如有漂浮细胞，需收集漂浮细胞和贴壁细胞合并染色；
2)     胰酶消化时间过短，细胞需要用力吹打才能脱落，容易造成细胞膜的损伤，导致7-AAD摄入过多；消化时间过长，细胞膜同样易造成损伤，甚至会影响细胞膜上PS与Annexin V-AF647的结合。
3)     尽量使用不含EDTA的胰酶，EDTA会影响Annexin V与PS的结合；如使用含EDTA的胰酶消化细胞，需要在染色之前用PBS洗涤细胞两次以去除EDTA。
4.    如果样品来源于血液，请务必除去血液中的血小板。因为血小板含有PS ，能与Annexin V结合，从而干扰实验结果。可以使用含有EDTA的缓冲剂并在1,500 rpm(200×g)离心洗去血小板。
5.    Annexin V-AF647和7-AAD是光敏物质，在操作时请注意避光。
6.    为了您的安全和健康，请穿实验服并戴一次性手套操作。