ClonPlus One Step Cloning Mix
最快5min定向无缝克隆 兼容性广阳性率高
一键复制信息
- 产品描述
- 组成成分
- 注意事项
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产品简介
ClonPlus 采用了一种简单、快速并且高效的 DNA 片段定向克隆技术，可将目的片段定向克隆至任意载体的任意位点。将载体进行线性化，在目的片段的两条 PCR 扩增引物的 5 ’端分别引入线性化载体的末端序列，使得目的片段经 PCR扩增后其 59端和39端分别带有与线性化载体的两个末端均有 15~20 nt 的同源序列。将两端带有同源序列的 PCR 产物与线性化的载体按一定比例混合后，在重组酶的催化下，只需 5~45 min 就可以实现 DNA 片段的定向克隆。
ClonPlus One Step Cloning Mix 无缝克隆试剂盒，一次反应可高效完成单个至多个 DNA 片段的同源重组，兼容性广且阳性率高。
储存条件
本产品需置于-20℃中储存，使用时尽可能避免反复冻融。
使用方法
一、实验流程概要
二、线性化载体制备
选择合适的克隆位点，对载体进行线性化。尽量选择无重复序列且克隆位点上下游25 bp 区域内GC 含量在40%~ 60%之间的位点进行克隆。载体的线性化可以通过酶切或反向 PCR 扩增完成，推荐使用酶切方法，简便快捷。
1. 限制性内切酶酶切
单酶切或双酶切都可以，推荐使用双酶切进行载体的线性化。可以适当延长酶切时间，使载体线性化完全，减少环状质粒残留， 以降低转化背景（假阳性克隆）。
2. 反向 PCR 扩增
使用反向 PCR 扩增制备线性化载体时，推荐使用高保真 DNA 聚合酶进行载体扩增， 以减少扩增过程中引入碱基突变。推荐使用预线性化质粒作为模板，以减少环状质粒模板残留对克隆阳性率的影响。若以环状质粒为模板，PCR产物需使用 Dpn I 对残留的环状质粒进行消化后再纯化回收。
三、 目的片段获得
推荐使用高保真 DNA 聚合酶对目的片段进行扩增，以减少扩增过程中引入碱基突变。建议将 PCR 产物纯化后再进行同源重组反应。使用酶切法将载体线性化后，载体的两个末端均是黏性末端，即均有几个碱基突出来，在设计引物时，突出来的碱基可包含在引物中，也可不包含。或者整个酶切位点也可包含在引物中，也可不包含。
1. 单个片段的引物设计
正向引物：载体的上游末端正链 15~20 nt+ 目的片段的上游末端正链 18~25 nt（5, →3,）
反向引物： 目的片段的下游末端互补链 18~25 nt+载体的下游末端互补链 15~20 nt（3, →5,）
注：将反向引物序列发送给引物供应商合成时，需发送 5, →3,的序列。
举例：
线性化载体序列：5,-GCCAAATCTGCATCG----------TGCTAGAGCTGATTG-3,
3,-CGGTTTAGACGTAGC- - - - - - - -- -ACGATCTCGACTAAC-5,
目的片段序列： 5,-CATACGCCCATCGGTGGA----------TATGGTCACCGACGTTAG-3, 3,-GTATGCGGGTAGCCACCT- - - - - - -- - -ATACCAGTGGCTGCAATC-5,
正向引物设计： 5,-GCCAAATCTGCATCGCATACGCCCATCGGTGGA-3,
反向引物设计： 3, -ATACCAGTGGCTGCAATCACGATCTCGACTAAC-5,
2. 多个片段的引物设计
左侧片段的正向引物：载体的上游末端正链 15~20 nt+左侧片段的上游末端正链 18~25 nt（5, →3,）
左侧片段的反向引物：左侧片段的下游末端互补链 18~25 nt+中间片段的上游末端互补链 15~20 nt（3, →5,）
中间片段的正向引物：左侧片段的下游末端正链 15~20 nt+中间片段的上游末端正链 18~25 nt（5, →3,）
中间片段的反向引物：中间片段的下游末端互补链 18~25 nt+右侧片段的上游末端互补链 15~20 nt（3, →5,）
右侧片段的正向引物：中间片段的下游末端正链 15~20 nt+右侧片段的上游末端正链 18~25 nt（5, →3,）
右侧片段的反向引物：右侧片段的下游末端互补链 18~25 nt+载体的下游末端互补链 15~20 nt（3, →5,）
注：将反向引物序列发送给引物供应商合成时，需发送 5, →3,的序列。
举例：
线性化载体序列：5,-GCCAAATCTGCATCG----------TGCTAGAGCTGATTG-3,
3,-CGGTTTAGACGTAGC- - - - - - - -- -ACGATCTCGACTAAC-5,
左侧片段序列： 5,-GGCACTTACCCCAATCAT----------AAGGCCCTATATCCAATT-3, 3,-CCGTGAATGGGGTTAGTA- - - - - - - -- -TTCCGGGATATAGGTTAA-5,
中间片段序列： 5’-TATATGGCCATACGTAAT----------TTAACCCATGGTGGACCT-3 ’ 3’-ATATACCGGTATGCATTA- - - - - - - -- -AATTGGGTACCACCTGGA-5’
右侧片段序列： 5’-CATACGCCCATCGGTGGA----------TATGGTCACCGACGTTAG-3 ’ 3’-GTATGCGGGTAGCCACCT- - - - - - -- - -ATACCAGTGGCTGCAATC-5 ’ 左侧片段的正向引物设计：5’-GCCAAATCTGCATCGGGCACTTACCCCAATCAT-3 ’
左侧片段的反向引物设计：3’ -TTCCGGGATATAGGTTAAATATACCGGTATGCATTA-5 ’
中间片段的正向引物设计：5’-AAGGCCCTATATCCAATTTATATGGCCATACGTAAT-3 ’
中间片段的反向引物设计：3’ -AATTGGGTACCACCTGGAGTATGCGGGTAGCCACCT-5 ’
右侧片段的正向引物设计：5’-
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产品组成
组分 规格 货号 ClonPlus One Step Cloning Mix 250 μL 500-201A pUC19 Control Vector, Linearized (Amp＋, 40 ng/ μL) 5 μL 500-201B 500 bp Control Fragment (20 ng/ μL) 5 μL 500-201C -
常见问题与解决方案
1. 平板上仅有少数克隆。
使用转化效率大于 108 cfu/ μg 的感受态细胞进行转化。
将线性化载体和目的片段的 PCR 产物进行凝胶回收纯化，纯化产物溶解在 ddH2O 中。
2. 较多克隆不含目的片段。
增加限制性内切酶的使用量或延长酶切反应时间或胶回收纯化酶切产物。
3. 较多克隆含有不正确的目的片段。
优化 PCR 反应体系，提高特异性。
胶回收纯化 PCR 产物。
4. 较多克隆的菌落 PCR 无条带。
优化 PCR 反应体系和反应程序。
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