流式样本处理：肠道组织单细胞悬液制备
发布时间:2026-09-21
肠道黏膜固有层淋巴细胞（LPL）是肠道免疫研究的核心细胞群体，在流式细胞术检测中，高质量单细胞悬液是实验成功的关键。肠道组织结构复杂，含有大量黏液、粪便残渣、上皮细胞，容易出现细胞成团、死细胞多、杂细胞污染等问题。本文教你用小鼠回肠、结肠黏膜组织为样本，制备适用于流式检测的肠道单细胞悬液，包含试剂耗材、完整操作流程、细胞质控方法，可获得高活率、低结团的肠道固有层单细胞样本，满足后续流式表型、凋亡检测等实验需求。
| 产品名称 | 用途 |
|---|---|
| RPMI 1640 培养液 | 细胞重悬、培养使用 |
| 无 Ca²⁺、Mg²⁺PBS 缓冲液 | 组织漂洗、细胞洗涤 |
| Percoll 细胞分离液 | 配制 80%、40% 等渗 Percoll 梯度溶液 |
| Ⅷ 型胶原酶 | 工作浓度 1.5 g/L，用于固有层组织消化 |
| 胎牛血清（FCS） | 终浓度 10%，保护细胞，降低机械损伤 |
| DNA 酶 Ⅰ | 工作浓度 100 kU/L，减少细胞结团 |
| EDTA、HEPES、DTT | 配制组织分离、消化工作液 |
| Stain buffer | 流式染色缓冲液 |
| 细胞筛网 | 100 μm、70 μm 尼龙筛网，去除组织碎片 |
提示：所有组织操作环节尽量使用预冷缓冲液，降低细胞凋亡；DNA 酶可降解细胞裂解释放的 DNA，显著改善细胞结团现象，是肠道单细胞制备的关键试剂。
颈椎脱臼法处死小鼠，快速取出 7‑8 cm 回肠 + 结肠肠管，置于预冷 PBS缓冲液中。
小心剔除肠系膜、脂肪组织以及集合淋巴结；沿肠系膜侧纵向剪开肠管。
使用预冷 PBS反复漂洗肠内壁，彻底清除粪便、黏液。
将清洗干净的肠管横向剪切成 0.5‑1.0 cm 的组织片段，备用。
将全部肠组织片段转移至 50 mL 离心管，加入 5 mL 分离液；37 ℃恒温振荡箱 250 r/min 震荡 15 min。
取出后涡旋振荡 30 s，经 100 μm 尼龙滤网过滤，该滤液主要为上皮细胞与上皮内淋巴细胞，如需要这部分细胞可以收集起来；管内保留组织块。
将组织片段放到一个新的离心管，再次加入 5 mL 分离液，重复震荡、涡旋、过滤步骤，充分剥离肠上皮层。
将剥离上皮后的肠组织转移至全新 50 mL 离心管，加入 5 mL 消化液（含 Ⅷ 型胶原酶、DNA 酶 Ⅰ），37 ℃、250 r/min 震荡消化 45 min。
消化结束涡旋 30 s，使用100 μm 滤网过滤，收集滤液至 一个新的离心管中。4 ℃，400×g 离心 10 min，弃上清，沉淀即为含有肠道的固有层淋巴细胞的粗细胞沉淀。
该步骤去除组织碎片、死细胞、细胞碎片，得到纯度更高的固有层淋巴细胞，适配流式上机。
取新 15 mL 离心管，管底铺入 4 mL 80% 等渗 Percoll 溶液。
使用 8 mL 40% 等渗 Percoll 溶液充分重悬上一步的细胞沉淀；离心管倾斜，将 40% Percoll 细胞悬液沿管壁缓慢叠加在 80% Percoll 下层之上，形成清晰两层分界面。
20 ℃，500×g，条件下离心 20 min。注意：离心机升速度和降速度都要调到0。
弃上层液体，保留约 7 mL 体系，小心吸取两层液面之间乳白色不透明细胞层，转移至新 15 mL 离心管。
加入 PBS补至 15 mL 混匀洗涤；4 ℃，400×g 离心 8 min，弃上清。
1.解离完成后应立即进行细胞活率与浓度评估。
1.1细胞计数与形态、结团检测。
倒置显微镜观察组织消化状态；统计总细胞数。
1.2 台盼蓝染色快速检测活率。
取 10 μL 细胞悬液与 90 μL 0.4% 台盼蓝充分混匀，室温孵育 3 min；计数仪检测，未染色的细胞是活细胞，染色的是死细胞。
1.3流式凋亡染色评估细胞质量（Annexin V/PI货号：100-101）
采用 Annexin V‑FITC/PI 凋亡试剂盒（推荐货号：100-101）通过流式细胞仪检测细胞凋亡坏死水平。该制备方法得到的样本流式活细胞率可达 (94.5±3.2)%，死细胞与早期凋亡细胞占比低，样本质量可靠，适合后续流式表型分析、细胞因子检测等实验。
短期保存建议将细胞重悬于含0.04% BSA的PBS或含1% FBS的PBS中，置于冰上。若需进行流式标记，应避免使用含叠氮钠的缓冲液，因其可能影响某些荧光染料的信号。
肠道富含黏液与粪便，充分漂洗是前提，残留粪便会严重干扰消化、过滤与流式结果。
上皮去除步骤不可省略：如果上皮细胞残留，会大量混杂在 固有层淋巴细胞 样本中，造成流式背景升高。
Percoll 梯度离心必须设置离心机的升降速为 0，否则会破坏梯度界面，细胞纯化失败。
DNA 酶必须添加：肠道组织裂解会释放基因组 DNA，造成细胞黏连结团，直接影响流式上机。
消化时间严格控制，消化过度会造成细胞死亡增加；消化不足会导致细胞得率偏低。
全程尽量低温操作，减少体外细胞凋亡，保证流式样本真实反映体内免疫状态。
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