流式样本处理：肺组织单细胞悬液制备
发布时间:2026-09-17
肺组织因其复杂的细胞组成——包括上皮细胞、内皮细胞、间质细胞以及多种免疫细胞——成为流式细胞术分析中颇具挑战性的样本类型。与脾脏或淋巴结等淋巴器官不同，肺组织含有大量弹性纤维和胶原基质，需要特定的解离策略才能获得高质量的单细胞悬液。
与此同时，肺循环中残留的红细胞和肺泡巨噬细胞的自发荧光特性，也对样本制备提出了额外要求。因此单细胞悬液制备的关键在于：充分灌注去血、适度酶消化、温和过滤、准确计数。
肺组织细胞异质性强，流式分析需关注三类细胞：免疫细胞（CD45⁺）、上皮细胞（CD326⁺CD31⁻CD45⁻）、内皮细胞（CD326⁻CD31⁺CD45⁻）。
样本处理有三个难点：
血管灌注：肺血供丰富，不灌注会导致大量外周血细胞混入，干扰免疫细胞分析。
弹性纤维与胶原：单纯机械解离不够，需胶原酶+DNase I联合消化。
自发荧光：肺泡巨噬细胞在FITC/PE通道易造成假阳性，设门时需注意区分。
常用酶消化体系：Liberase（温和、抗原保留好）或胶原酶IV + DNase I（经济通用）。
储备液配制（全程无菌，分装冻存，避免反复冻融）
DNase I母液（10 mg/mL）：无菌双蒸水溶解冻干粉至10 mg/mL，单组分分装，-20℃避光保存，一次性使用。
IV型胶原酶母液（10 mg/mL）：无菌双蒸水溶解至10 mg/mL，单组分分装，-20℃避光保存，一次性使用。
灭活FBS：37℃水浴融化后转56℃水浴30分钟灭活补体，超净台内0.22 μm滤膜过滤除菌，50 mL管分装，-20℃保存。
肺组织消化缓冲液（现配现用，20 mL体系）：以RPMI 1640 + 10%灭活FBS为基础液，加入胶原酶IV至0.2 mg/mL、DNase I至0.05 mg/mL。配好后室温短期放置即可；若需放置数小时，应冰浴以延缓酶失活。
要点：消化液现配优先，胶原酶活性依赖室温环境；母液一律分装冻存，禁止反复冻融。
试剂清单：IV型胶原酶、DNase I、DPBS、Ficoll-Paque、1×红细胞裂解液、无菌PBS、0.4%台盼蓝。
设备清单：超净工作台、37℃ 5% CO₂培养箱、离心机、细胞计数仪、无菌精细剪刀、2 mL微量离心管、6孔细胞培养板、50 mL锥形离心管、10 mL无菌移液管、70 μm细胞筛、细胞计数板。
保持低温。除酶消化步骤外，所有操作应在冰上或4°C进行，以降低细胞代谢和表面抗原内吞。
快速操作。组织离体后应尽快进入消化流程，延迟超过30分钟将显著降低活细胞回收率。
DNase I的时效性。DNase I活性会随时间下降，建议消化液现配现用，避免反复冻融。
提前配好20 mL肺消化缓冲液。Ficoll-Paque和1×红细胞裂解液从4℃取出，室温平衡备用。肺活检样本（1–2 cm组织块）置于2 mL含0.5 mL消化缓冲液的微量离心管中暂存。
用无菌精细剪刀将管内肺组织剪成1–2 mm的小碎块，保证酶液能充分浸润组织。
将全部组织碎块连同管内消化液转移至6孔板单孔，额外补加4 mL新鲜消化缓冲液（单孔总消化液约4.5 mL）。6孔板置于37℃培养箱，恒温孵育1小时。
孵育结束后，用10 mL无菌移液管轻柔上下吹打组织混合液6–8次（帮助单细胞释放），打散尚未完全解离的组织团块。
70 μm细胞筛架在50 mL锥形管上方，将消化悬液全部过筛。原6孔板用1 mL PBS润洗，润洗液同样过筛并入同一管，减少细胞丢失。
将肺悬液的体积调整至 50 毫升，同时使用 PBS 溶液进行稀释。365×g、25℃离心5min。将上清液去除，然后将细胞沉淀重新悬浮在 40 毫升的 PBS 溶液中，以充分稀释肺细胞悬液。
新50 mL管底部先铺10 mL室温Ficoll-Paque。
缓慢沿管壁将40 mL稀释细胞悬液平铺于Ficoll上层，严禁两层液体混合。
离心参数：1800×g，室温，25分钟；加速档0–1、刹车档0–1（无减速，避免分层被破坏）。
离心后可见分层：上层PBS、中间白膜层（单个核细胞）、下层Ficoll、底部红细胞沉淀。
收集位于血浆-PBS-Ficoll-Paradigm 界面处的单核细胞层，转移至全新50 mL离心管，PBS加满至50 mL。
365×g、4℃离心5分钟，需要注意的是：要将离心机的加速度设置到最大水平，同时也要使用最大的制动力量，弃全部上清。
细胞沉淀重悬于1 mL室温1×红细胞裂解液，室温避光孵育5分钟。
PBS补足至50 mL，365×g、4℃离心5分钟，弃上清。
吸取上层清液，然后将含有 DC 的细胞沉淀重新悬浮在 1 毫升 PBS 中。在 96 孔板中，将 10 µL 的台盼蓝与 10 µL 的细胞悬液混合，然后向计数室加入 10 µL 的溶液来进行计数。之后继续进行流式细胞术染色操作。
环节 | 关键控制点 | 常见问题 |
消化液配制 | 现配现用，胶原酶活性依赖室温；放置数小时需冰浴 | 放置过久→酶活性下降→解离不充分 |
组织剪碎 | 剪至1–2 mm碎块，保证酶液充分浸润 | 碎块过大→消化不均→细胞团块残留 |
酶消化 | 37℃恒温1小时，避免温度波动 | 时间过长→活率下降；过短→细胞释放不足 |
机械吹打 | 10 mL移液管轻柔吹打6–8次 | 用力过猛→细胞破碎；次数过少→团块残留 |
Ficoll离心 | 加速档0–1、刹车档0–1，无减速 | 减速过快→分层被破坏→白膜层难收集 |
白膜层收集 | 小心吸取中间层，避免吸入上下层 | 吸到Ficoll→细胞活性下降；吸到红细胞→污染 |
红细胞裂解 | 室温避光5分钟，及时终止 | 时间过长→白细胞损伤；时间过短→红细胞残留 |
全程低温 | Ficoll离心后所有步骤使用4℃预冷PBS | 温度偏高→抗原内吞、凋亡增加 |
整个流程可以概括为 “一配、二剪、三消化、四过滤、五离心、六富集、七裂解、八计数”
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