从人全血分离 PBMC 实操指南，免疫磁珠细胞分选前置标准流程
发布时间:2026-06-26
外周血单个核细胞（PBMC）包含 T 细胞、B 细胞、NK 细胞与单核细胞，是绝大多数人源免疫研究的起始材料。无论是流式检测、原代细胞培养，还是热门的免疫磁珠细胞分选、单细胞多组学测序，一份纯度高、活性完好的 PBMC 都是实验成功的基础。
实验室常规采用密度梯度离心法分离 PBMC，依靠 1.077±0.001 g/mL 淋巴细胞分离液，根据不同血细胞密度实现分层，轻松从新鲜抗凝全血中富集单个核细胞。
不少科研人员会直接用全血进行磁珠标记，容易出现大量红细胞、血小板杂带，数据重复性差。行业通用标准流程为先纯化 PBMC，再通过磁珠分选试剂盒富集目标免疫亚群，信天翁生物 FiniGet 分必得®无柱阴性分选体系，可直接以 PBMC 为样本，快速分选出人 CD4+T、CD8+T、单核细胞，全程无需分离柱，最大程度保留细胞静息状态。
本文方案适配 EDTA-K₂或枸橼酸钠抗凝的新鲜人外周血，分离得到的 PBMC 可直接用于各类细胞分选相关实验，支撑免疫表型分析、细胞因子检测、T 细胞诱导分化等研究。
一、普通离心管 PBMC 分离通用流程
实验所需样本与试剂耗材
实验样本优先选择采血 24 小时内的新鲜抗凝全血；核心试剂包含货号 100-306 人淋巴细胞分离液，以及货号 140-2001 无钙镁 PBS 缓冲液（添加 2% FBS，用于稀释与洗涤细胞）。
操作时准备无菌 15mL、50mL 离心管、巴氏吸管、带缓升缓降功能的水平转子离心机，搭配细胞计数板与台盼蓝染液完成活率质控。完整操作步骤
- 血液稀释 取平衡至室温的抗凝全血，与含 2% FBS 的 PBS 按 1:1 比例混合，轻柔吹打 3-5 次混匀，避免剧烈机械损伤细胞。
- 铺层与梯度离心 取新离心管，加入和稀释血液等体积的淋巴细胞分离液。将移液管紧贴管壁缓慢叠加稀释血液，保证两层液体界面清晰不混合。配平后放入水平离心机，室温 18-22℃，400-800g 离心 20 至 30 分钟，加速与减速档位全部调至最低，防止成型梯度被打散。
- 收集白膜层 PBMC 离心完成后管内会分层四层，中间云雾状白膜层即为目标 PBMC。沿血浆与白膜层交界处缓慢伸入吸管，完整吸取中间细胞层，尽量减少上层血浆、底层分离液的混入，转移至新无菌离心管。
- 加入约三倍体积 PBS 轻柔重悬细胞，室温 300g 离心 10 分钟弃上清；再次用 PBS 重悬沉淀，调整离心力至 200g 离心 10 分钟，有效去除大部分血小板污染。洗涤完成后的细胞悬液，即可进入免疫磁珠分选环节。
二、SepAid™专用分层管快速分离方案
针对大批量样本处理场景，SepAid™专用离心管（货号 140-2010、140-2011）自带隔离隔层，简化铺层操作、大幅缩短离心时长，整套试剂与基础方案通用。
- 血液稀释 取平衡至室温的抗凝全血，与含 2% FBS 的 PBS 按 1:1 比例混合，轻柔吹打 3-5 次混匀，避免剧烈机械损伤细胞。
- 通过离心管隔层中间的圆孔加入15mL的淋巴细胞分离液。将移液管紧贴管壁缓慢加入稀释过的血液。配平后放入水平离心机，室温 1200g 离心10min，加速与减速档位可保持最高。
- PBMC 离心完成后管内会分层四层，中间云雾状白膜层即为目标 PBMC。为了减少血小板，可去除部分血浆层。通过直接倾倒，将上层液体倒入新的离心管中。
- 加入约三倍体积 PBS 轻柔重悬细胞，室温 300g 离心 10 分钟弃上清；再次用 PBS 重悬沉淀，调整离心力至 200g 离心 10 分钟，有效去除大部分血小板污染。洗涤完成后的细胞悬液，即可进入免疫磁珠分选环节
三、影响 PBMC 纯度与后续细胞分选效果的关键质控细节
很多人分离后 PBMC 杂细胞多、细胞活率低，最终导致磁珠分选背景偏高，大多是操作细节把控不到位，核心注意事项整理如下：
- 所有试剂提前回至室温，低温会改变分离液密度，分层模糊，直接提升分选杂带；
- 仅可使用水平转子离心机，角转子会破坏梯度界面，PBMC 损失严重，无法满足细胞分选要求；普通离心管务必开启缓升缓降；
- 移液、吹打、倾倒全程动作轻柔，剧烈扰动会破坏分层，增加红细胞、血小板污染；
- 样本时效性至关重要，采血后 6 小时内处理细胞活率最佳；4℃冷藏存放不可超过 48 小时，超时细胞凋亡明显，后续分选得率、纯度都会大幅下降。
四、PBMC 下游：免疫磁珠分选两种方案对比
纯化后的 PBMC 是细胞分选实验的标准原料，目前实验室主流分为传统柱式磁珠分选与 FiniGet 分必得无柱分选两种路线： 传统柱式分选需要搭配专用分离柱，样本密度偏高时极易堵塞，细胞损耗大，整套操作耗时半小时以上； FiniGet 无柱分选试剂盒无需配套分离柱，普通台式磁架即可完成分离，最快15 分钟就能富集人源 CD4、CD8 T 细胞。
负选试剂盒分选过程仅去除杂细胞，目标细胞表面无磁珠、抗体附着，不会造成 T 细胞提前活化，适配单细胞测序、细胞功能验证等高精度实验。
五、实验高频问题解答
Q1 血液样本最晚存放多久还能做 PBMC 分离和磁珠分选？
A：采血后 6 小时内处理效果最优，PBMC 活率稳定在 95% 以上，分选结果重复性好。若无法及时处理，可短期 4℃冷藏，但总时长不能超过 48 小时；存放过久细胞凋亡加剧，不建议用于功能性分选实验。
Q2 离心后看不到清晰白膜层，收集不到 PBMC 是什么原因？
A：常见诱因包含分离液未恢复室温、离心机减速档位过高破坏梯度、血液稀释比例失衡；高血脂、白血病病理样本或放置超期的血液，也会出现分层不明显的情况，可针对性调整试剂温度、离心参数或更换新鲜样本。
Q3 PBMC 沉淀混有大量红细胞，干扰后续细胞分选怎么办？
A：若红色沉淀明显，洗涤后加入红细胞裂解液室温处理 3-5 分钟，立刻加入大量 PBS 终止裂解，充分洗涤后再开展磁珠分选。
Q4 怎样减少血小板污染，降低磁珠非特异性结合？
A：第二轮洗涤时将离心力下调至 120-150g，离心 5-8 分钟；弃上清时保留约 1mm 液体，不要完全吸净管底，血小板会留存于上清，减少分选背景干扰。
Q5 分离后细胞活率不足 90%，无法开展 T 细胞分选实验？
A：细胞活率偏低一般是离心力过大、吹打操作剧烈、样本存放超时、试剂温度异常导致。严格控制离心参数、轻柔处理细胞、使用新鲜血液样本，可稳定将细胞活率维持在 95% 以上。
Q6 实验室只有角转子离心机，能否用来分离 PBMC？
A：不推荐。角转子离心后细胞沉淀倾斜，梯度界面被破坏，PBMC 损耗量大，最终免疫磁珠分选纯度难以达标，规范实验必须使用水平转子设备。
Q7 常规离心管分离 PBMC，为什么要调低加速、减速？
A：加速过快会让血液与分离液提前混合，无法形成有效分层；高速刹车依靠惯性冲散成型的白膜层，直接造成 PBMC 大量流失，失去后续细胞分选的合格原料。
结语
密度梯度离心是制备 PBMC 最基础、标准化的前置手段，规范操作能为后续免疫磁珠分选、流式检测、原代细胞培养提供高质量单细胞样本。对比传统柱式分选方案，以 PBMC 为起始原料搭配 FiniGet 分必得无柱阴性分选试剂盒，既能简化人源免疫细胞分离流程，又能兼顾细胞纯度、活率与实验重复性，是国内免疫学、转化医学科研稳定可靠的细胞分选整体方案。
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