RNA提取浓度低，还能往下做逆转录和qPCR吗？
发布时间:2025-07-18
之前一期，我们介绍过，提取出的RNA浓度在哪些范围比较合适。
经常有一些小伙伴在后台问，提取出的RNA浓度很低，还能不能往下做逆转录和qPCR，今天给大家介绍一下。
为什么提取出的RNA浓度低？
以传统的trizol法提取为例，当RNA提取浓度低于预期（<20 ng/μL），建议从以下三方面排查：
1、样本因素
起始材料不足
穿刺组织、单细胞、体液游离 RNA 等样本因生物量低导致浓度不足，建议增加样本量或采用微量提取试剂盒。
样本降解风险
坏死组织、离体超 2 小时的样本内源 RNase 活性高，需取材后立即用 RNA 保护剂处理或液氮冻存。
2、操作因素
裂解不充分
肌肉、纤维组织等结构坚韧，常规研磨难以彻底破碎细胞，导致 RNA 释放不充分。需延长研磨时间，或采用机械研磨结合强效裂解液的方式。
沉淀不完全
乙醇沉淀时温度、时间不足，会降低 RNA 回收率，应确保在 - 20℃沉淀足够时间。
洗脱体积不当
洗脱体积过大直接稀释 RNA 浓度，推荐使用20- 30 μL 无酶水洗脱。
3、污染
耗材污染
普通塑料耗材表面可能残留 RNase，未经 DEPC 处理的水、枪头，RNase 活性可在 30 分钟内降解 90% 以上的 RNA。所有耗材必须为RNase - free。
操作污染
人体皮肤、唾液中富含 RNase，操作时未佩戴手套、频繁交谈，会引入外源 RNase。实验全程需佩戴无粉乳胶手套，且避免手套接触非实验物品；操作台用 75% 乙醇擦拭清洁。
4、储存不当
温度影响
4℃短期储存时间过长，RNA 会因水分子作用缓慢降解；-20℃长期储存若反复冻融（超过 3 次），RNA 断裂率增加 50%。
分装方式
未分装的 RNA 样本，每次开盖都会引入湿气与氧气，加速 RNA 氧化降解。建议根据实验用量精确分装，减少样本暴露次数。
关键提示：浓度低不等于质量差！通过以下指标验证
Nanodrop：A260/A280=2.0（无蛋白/溶剂污染）
电泳：28S/18S条带清晰
当浓度偏低时，若 A260/A280 在2.0 左右且电泳条带完整，仍可用于 qPCR 等对完整性要求高的实验，无需重复提取。
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