GF647 EdU细胞增殖检测试剂盒
应用：
种属反应性：
宿主种属：
无需使用抗体 操作简单灵敏度高
一键复制信息
- 产品描述
- 组成成分
- 注意事项
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产品简介
EdU (5-Ethynyl-2,- deoxyuridine)是一种胸腺嘧啶核苷类似物，可以代替胸腺嘧啶(T)掺入到正在复制的 DNA 分子中，随后 EdU 与荧光染料发生快速的点击反应，新合成的 DNA 分子被荧光标记，通过检测荧光信号可快速检测细胞的增殖能力。 EdU 法无需使用抗体、操作简单、灵敏度高，是一种在 BrdU 法基础上升级的新方法。本试剂盒可用于培养细胞及组织切片的检测。
货号规格
货号 产品名称 规格 100-121 EdU-488 细胞增殖检测试剂盒 100T 100-122 EdU-594 细胞增殖检测试剂盒 100T 100-123 EdU-555 细胞增殖检测试剂盒 100T 100-124 EdU-647 细胞增殖检测试剂盒 100T 保存条件
本产品冰袋运输，4˚C 保存，一年内有效。注： Hoechst 33342 (试剂 F)，可分装后-20˚C 保存，短期内使用可保存于4˚C。荧光试剂注意避光使用。冰袋运输。
自备试剂
1. 10 mM PBS（pH7.2-7.6）
2. 细胞固定液（含 4%多聚甲醛的 PBS）
3. 透膜液（0.2% Triton X-100 in PBS）
4. 细胞培养板（48/24/12/6 孔板）；流式细胞分析管(如 12×75 mm)。
使用说明（贴壁细胞）
细胞培养
每孔接种 0.5×105 ~1×106 细胞于 12 孔板中，细胞正常生长且密度不超过 80%为宜。
EdU 标记
1. 设置 1 个不加 EdU 培养基的阴性对照组，以便进行流式检测数据的染料背景分析。
2. 用细胞培养基将 1000 X 的 EdU 溶液(试剂 A)稀释至 1X，制备适量 50 μM EdU 培养基。
注意： 1）EdU 浓度与孵育时间相关，短时间孵育育（<2h）宜采用高浓度（10~50 μM），长时间孵育（>24h）
宜采用低浓度（10 μM）；
3. 将细胞培养基更换为 EdU 培养基，每孔加入 0.5mL，孵育 2 小时。
注意： 1）最佳孵育时间与细胞周期相关（表 1），大多数肿瘤细胞系均可采用 2 小时孵育时间；
2）EdU 培养基用量参考表 2；
表 1. EdU 孵育时间参考
细胞系 人胚胎细胞 人神经细胞 人宫颈癌细胞 人胚肾细胞系 酵母细胞 细胞周期 30 min 5d 20-24h 22-25h 3h 孵育时间 5min 1d 2h 2h 20min 表 2. EdU 培养基及染色反应液的使用量参考
96 孔板 48 孔板 24 孔板 12 孔板 6 孔板 EdU 培养基 100 μL 200 μL 300 μL 500 μL 1 mL 染色反应液 100 μL 200 μL 300 μL 500 μL 1 mL 备注：表 2 为贴壁细胞的使用量参考，悬浮细胞和组织切片的使用量适当调整。
EdU 检测
a. EdU 标记完成后，吸去培养基，用 PBS 洗涤细胞 1 次。
b. 每孔加入 0.5 mL 的固定液，室温固定 10 分钟。注意：如果用于流式测试，则用胰酶消化之后再进行固定。
c. 去除固定液，用 PBS 洗涤细胞 2 次。
d. 去除 PBS，每孔加 0.5 mL 透膜液 0.2% TritonX-100 室温孵育 10 分钟。
e. 去除透膜液，用 PBS 洗涤细胞 2 次。
f. 配制缓冲添加剂溶液：用 1.3 mL 去离子水溶解一管缓冲添加剂(试剂 E)，混匀至全部溶解，即为缓冲添加剂溶液。配制后适当分装，并于-20ºC 保存。缓冲添加剂溶液在使用过程中如果出现变色成棕色，则弃用。
g. 参照表 3 按顺序进行 EdU 反应液的配制：
h. 去除 PBS，每孔加入 500 μL EdU 反应液，室温避光孵育 30 分钟。
i. 去除 EdU 反应液，用 PBS 洗涤细胞 2-3 次。
j. 染核，用 PBS 将 500X 的 Hoechst 33342(试剂 F)稀释成 1X 的染色工作液，每孔加入 0.5 mL 染色工作液，室温避光染色 5-10 分钟。
k. 去除染色工作液，用 PBS 洗涤细胞 2 次。
l. 荧光显微镜检测。如果条件限制，请避光 4℃湿润保存，3 天之内检测。
表 3. EdU 反应液的配制参考
组分 12 孔板样品数 1 2 3 4 10 反应缓冲液(试剂 B) 464 μL 928 μL 1392 μL 1856 μL 4640 μL 催化剂溶液(试剂 C) 10 μL 20 μL 30 μL 40 μL 100 μL 荧光染料溶液(试剂 D) 1 μL 2 μL 3 μL 4 μL 10 μL 缓冲添加剂溶液 25 μL 50 μL 75 μL 100 μL 250 μL 总体积 500 μL 1 mL 1.5 mL 2 mL 5 mL 注意：按顺序配制适量 EdU 反应液 (现用现配，30 分钟内使用)
使用说明（组织切片）
动物体内 EdU 的标记及切片样品的处理
a. 动物体内 EdU 的标记可参考相关文献。对于小鼠，可按照 10-200 mg/kg 的用量，把 EdU 用 PBS 配制成一定浓度，腹腔注射、特定组织或器官局部注射或者加入饮用水中 ，初次使用时建议对 EdU 的使用浓度进行一定的摸索。
b. 标记 4 小时后或根据特定实验确定的适当时间后，取出所需的组织，按照常规步骤制作冰冻切片或石蜡切片。 EdU 标记的时间也可以参考相关文献自行调整。
c. 对于冰冻切片：
1) 可在组织周围用组化笔画圈，圈中滴加适量固定液，室温固定 15 分钟。
2) 去除固定液，用 PBS 洗涤 2-3 次，每次 3 分钟。
3) 去除 PBS ，滴加适量透膜液室温孵育 10-15 分钟。
4) 去除透膜液，用 PBS 洗涤 2 次，每次 3 分钟。
d. 对于石蜡切片：
1) 脱蜡：二甲苯脱蜡 5-10 分钟，换用新的二甲苯脱蜡 5-10 分钟。无水乙醇 2 分钟，换新的无水乙醇 2 分钟。 90%乙醇 2 分钟。80%乙醇 2 分钟。70%乙醇 2 分钟。PBS 5 分钟。
2) 去除 PBS ，滴加适量透膜液室温孵育 10-15 分钟。
3) 去除透膜液，用 PBS 洗涤 2 次，每次 3 分钟。
EdU 检测
a. 配制缓冲添加剂溶液：用 1.3 mL 去离子水溶解一管缓冲添加剂(试剂 E)，混匀至全部溶解，即为缓冲添加剂溶液。配制后适当分装，并-20ºC 保存。缓冲添加剂溶液在使用过程中如果出现变色成棕色，则弃用。
b. 参照表 3 顺序进行 EdU 反应液的配制：
c. 去除 PBS，每个圈中滴加适量 EdU 反应液，室温避光孵育 30 分钟。
d. 去除 EdU 反应液，用 PBS 洗涤 3 次，每次 3-5 分钟。
e. 染核，用 PBS 将 500X 的 Hoechst 33342(试剂 F)稀释成 1X 的染色工作液，每个圈中滴加适量染色工作液，室温避光染色 5-10 分钟。
f. 去除染色液，用 PBS 洗涤细胞 2 次。
g. 用甘油或防荧光猝灭剂封片。
h. 荧光显微镜检测。如果条件限制，请避光于 4℃湿润保存 ，3 天之内检测。
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产品组分
组分 浓度 试剂量 EdU 溶液(试剂 A) 1000X 100 μL 反应缓冲液(试剂 B) 1X 50 mL 催化剂溶液(试剂 C) 50X 1000 μL 荧光染料溶液(试剂 D) 500X 100 μL 缓冲添加剂(试剂 E) 粉末 2 管 Hoechst 33342 (试剂 F) 500X 100 μL 备注：荧光光谱数据(Ex/Em)： 488 Azide：490/513 nm；555 Azide：550/561 nm；
594 Azide： 585/609 nm；647A Azide：648/664 nm.
Hoechst 33342 ：346/460nm.
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注意事项
1. EdU 使用浓度说明：本试剂盒推荐使用 50 μM 的浓度孵育 2 小时，由于细胞类型、密度以及细胞增殖速度都会影响 DNA复制过程中 EdU 的掺入，因此建议首次实验时对 EdU 的最佳使用浓度进行优化，以达到更好的实验效果；同时，可设不加 EdU 的阴性对照组 ，以便进行染色背景分析。
2. 组织切片染色过程中需防止干片，干片会导致背景过强影响实验结果。
3. 试剂平衡至室温并瞬时离心再使用。
4. 为了您的安全与健康，实验过程中请穿实验服并佩戴口罩和一次性手套。
关键词
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