AF647 Rat Anti-mouse PD-1 Antibody（RMP1-14）
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TL;DR：NeoMab 26-2279-12 AF647 标记大鼠抗小鼠 CD279（PD-1）单克隆抗体（RMP1-14 克隆），特异性识别小鼠 PD-1 分子（Programmed Death-1，50-55 kDa），标记活化 T/B 细胞及胸腺 CD4+CD8+ 亚群；抗体浓度 0.5 mg/mL，推荐用量 ≤1.0 µg/百万细胞；红光（633 nm）激发，发射波长 664 nm；适用于流式细胞术（Flow Cytometry）检测小鼠 PD-1 表达；RMP1-14 已报道可阻断 PD-1 与配体（PD-L1/PD-L2）结合；2-8℃ 避光保存，两年有效。
应用领域：肿瘤微环境免疫检查点研究、T 细胞耗竭（Exhaustion）表型分析、PD-1/PD-L1 免疫通路机制研究、肿瘤免疫治疗（抗 PD-1/PD-L1 抗体）疗效评估、自身免疫病模型中 T 细胞活化状态监测、疫苗免疫应答中 T 细胞活化/耗竭动力学分析。
一、产品规格总表
参数 详情 产品名称 AF647 Rat Anti-mouse CD279(PD-1) Antibody (RMP1-14) 货号 26-2279-12（25 µg）/ 26-2279-15（100 µg） 克隆号 RMP1-14 宿主 / 亚型 Rat IgG2a, κ 偶联物 AF647（Allophycocyanin 647） 种属反应性 Mouse（小鼠） 验证应用 Flow Cytometry（流式细胞术） 激发 / 发射波长 648 nm / 664 nm 激发激光器 Red Laser（633 nm） 抗体浓度 0.5 mg/mL 推荐用量 ≤ 1.0 µg / 百万细胞（100 µL 染色体积） 保存条件 2-8℃ 避光保存，两年有效；冰袋运输
二、靶标背景 · 小鼠 CD279（PD-1）
小鼠 CD279（Programmed Death-1，PD-1）是分子量约 50-55 kDa 的免疫球蛋白超家族（IgSF）成员，由 Pdcd1 基因编码，Gene ID: 18566。PD-1 是一种关键的免疫检查点受体（immune checkpoint receptor），表达于一部分 CD4+CD8+ 胸腺细胞亚群，以及活化的 T 细胞和 B 细胞。
PD-1 在淋巴细胞克隆性选择和外周免疫耐受中发挥重要作用。PD-1 与其配体 PD-L1（B7-H1/CD274）和 PD-L2（B7-DC/PDCD1LG2）结合后，通过胞内 ITIM 和 ITSM 基序募集 SHP-2 磷酸酶，抑制 TCR 下游信号通路（包括 PI3K/AKT 和 Ras/MEK/ERK），从而负调控 T 细胞活化、增殖和效应功能。
表达分布：一部分 CD4+CD8+ 胸腺细胞亚群；活化的 T 细胞（TCR 刺激后上调）；活化的 B 细胞。在肿瘤微环境中，肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）持续高表达 PD-1，是 T 细胞耗竭（T cell exhaustion）的核心标志物。小鼠脾脏正常状态下 PD-1+ T 细胞比例较低（<5%），但在肿瘤、慢性感染或自身免疫模型中显著上调。
别名：Programmed Death-1、CD279、PD 1、PDCD1
Gene ID：18566（Mouse）
分布：活化 T/B 细胞、一部分 CD4+CD8+ 胸腺细胞、耗竭 T 细胞（TIL）
三、克隆号信息 · RMP1-14
RMP1-14 是抗小鼠 PD-1 最广泛使用的大鼠单克隆抗体克隆号之一，特异性识别小鼠 PD-1 分子胞外段。RMP1-14 不仅用于流式检测 PD-1 表达，还被报道具有功能性阻断活性——可阻断 PD-1 与其配体 PD-L1（B7-H1）和 PD-L2（B7-DC）的结合，并抑制巨噬细胞共刺激的 T 细胞增殖和细胞因子产生（但不阻断树突状细胞和 B 细胞介导的共刺激）。
功能特性：RMP1-14 的阻断活性使其在体外功能实验和体内阻断实验中均有应用价值。在流式染色之外，RMP1-14 也常用于：① 体外 PD-1 通路功能研究（阻断 PD-1/PD-L1 信号后检测 T 细胞增殖/细胞因子分泌变化）；② 体内免疫检查点阻断实验（小鼠肿瘤模型中注射 RMP1-14 评估抗肿瘤免疫应答）。
典型应用：肿瘤微环境中耗竭 T 细胞鉴定（PD-1+CD8+ TIL）、PD-1/PD-L1 免疫通路机制研究、肿瘤免疫治疗（抗 PD-1/PD-L1 抗体）疗效评估、慢性感染模型（LCMV、结核等）T 细胞耗竭动力学、自身免疫病模型（EAE、CIA）中 PD-1 调控作用研究、疫苗免疫应答中 T 细胞活化/耗竭平衡分析。
四、荧光素信息 · AF647
AF647（Allophycocyanin 647）是流式细胞术中常用的高亮度红色荧光染料，基于藻蓝蛋白（C-phycocyanin）衍生，激发峰 648 nm、发射峰 664 nm，由 633 nm 红光激光器激发。AF647 的量子产率高、光稳定性好，是 APC 的同系荧光素，二者光谱特性非常接近。
光谱特征：
参数 数值 激发波长 648 nm 发射波长 664 nm（远红色） 激光器 Red Laser（633 nm） 检测通道 APC-A / FL4（660/20 nm 滤光片） Stokes 位移 ~16 nm
肿瘤免疫 / 耗竭 T 细胞 Panel 搭配建议：AF647 发射峰尖锐（664 nm），与 FITC（526 nm）和 PE（578 nm）光谱溢出极小，是多色 Panel 的理想末端通道荧光素。PD-1 检测常见搭配：
• AF647-PD-1 + PE-CD8 + FITC-CD44 → 耗竭 CD8+ T 细胞鉴定（PD-1+CD44hi 亚群）
• AF647-PD-1 + PE-TIM-3 + FITC-CD8 → 多重耗竭标志物共表达分析（PD-1+TIM-3+ 深度耗竭）
• AF647-PD-1 + PE-CD3 + FITC-CD4 → 肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）中 CD4/CD8 亚群 PD-1 表达
• AF647-PD-1 + PE-PD-L1 + FITC-CD11b → 肿瘤微环境中 T 细胞 PD-1 vs 髓系细胞 PD-L1 共分析
• AF647-PD-1 + PE-Ki-67 → PD-1+ T 细胞增殖状态评估（需核内染色）
• AF647-PD-1 + PE-IFN-γ + FITC-TNF-α → 耗竭 T 细胞细胞因子分泌能力评估（胞内染色）注意事项：AF647 光稳定性好，但长时间暴露于强光仍可能淬灭，操作过程注意避光。AF647 与 APC 的发射光谱重叠较大（均约 660 nm 区域），同一 Panel 中不能同时使用 AF647 和 APC 标记的抗体。AF647 在酸性条件（pH < 4）下可能发生解离，确保染色缓冲液 pH 在 7.0-7.4。
五、流式染色 Protocol
所需试剂：
• NF0003 细胞染色缓冲液（PBS + 0.5-1% BSA + 0.05% NaN₃）
• NF0004-5 7-AAD 溶液（死细胞排除）
• Fc 受体封闭试剂（含单核/巨噬/B/NK 细胞样本推荐添加）
• 红细胞裂解液（全血或含红细胞组织样本选做）
操作步骤：
Step 1 · 制备单细胞悬液
收集所需组织（如脾脏、淋巴结、胸腺、骨髓、肿瘤组织），在细胞染色缓冲液（NF0003）中制备单细胞悬液。如果是体外培养的细胞，用染色缓冲液洗涤一次并重悬。调整细胞浓度为 5-10 × 10⁶ cells/mL，分装 100 µL/tube（5-10 × 10⁵ cells/tube）。
Step 2 · Fc 受体封闭
巨噬细胞、单核细胞、粒细胞、B 细胞、树突状细胞等表面表达 Fc 受体，会与抗体 Fc 段非特异性结合。推荐使用 Fc 受体封闭试剂，根据小鼠样本选用合适试剂，每管加入 5 µL，室温孵育 5-10 min，不用洗涤。
Step 3 · 抗体染色
每管加入流式抗体（按照 ≤ 1.0 µg/百万细胞 in 100 µL volume），轻轻混匀，冰上避光孵育 20-30 min。不同样本建议做滴定实验确定最适浓度。
Step 4 · 洗涤
用 1 mL 细胞染色缓冲液洗涤 1 次。
Step 5 · 7-AAD 活性染料染色
重悬细胞于 0.1 mL 染色缓冲液，每百万细胞加入 5 µL（0.25 µg）7-AAD Solution（NF0004-5），用于排除死细胞。
Step 6 · 孵育
冰上避光孵育 5-10 min。
Step 7 · 洗涤
用 1 mL 细胞染色缓冲液洗涤 1 次。
Step 8 · 上机检测
细胞重悬于 300-500 µL 细胞染色缓冲液中，上机测试。如不能及时测试，保存于 4℃ 并于 4 小时内完成检测。AF647 通道选择 APC-A / FL4（660/20 nm）。
（选做）红细胞裂解：全血或含红细胞组织样本，选用合适的红细胞裂解液并按说明书操作。
注意事项：使用前快速离心抗体管回收管壁上的抗体；不同样本建议做滴定实验确定最适浓度；本产品仅用于科研，请勿用于体外诊断。
六、对照设置指南
对照类型 用途与说明 空白对照（未染色） 评估细胞自发荧光，用于调节 PMT 电压 单染/单阳性对照 多色 Panel 中用于调节荧光补偿，每种荧光素各设一管 同型对照 AF647 标记的 Rat IgG2a, κ 同型抗体，消除非特异性背景染色。RMP1-14 为 Rat IgG2a, κ 亚型，同型对照的宿主、亚型和偶联物需完全一致 FMO 对照（Fluorescence Minus One） 多色 Panel 中去除某一种荧光素，用于准确设门，特别是 PD-1 低表达群体（如正常活化 T 细胞 PD-1 表达量较低）
提示：PD-1 在肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）上表达丰度高，阳性峰与阴性峰分离明显；但在正常活化 T 细胞上 PD-1 表达量较低（瞬时上调），建议设置同型对照或 FMO 对照以确保准确设门。
七、质量数据与参考文献
每批产品均经过严格质控，流式细胞术验证对小鼠 PD-1 的特异性染色性能，确认抗体效价、荧光素偶联效率及无菌性。批间一致性保证实验可重复性。
流式染色结果示例：AF647 CD279（RMP1-14）染色 CHO 细胞系，蓝色实线为稳定表达 CD279 的 CHO 转染株，黑色实线为未表达 CD279 的亲本 CHO 细胞（阴性对照），可见 PD-1 阳性与阴性群体明确分离。
参考文献：
1. Ishida Y, et al. EMBO J. 1992;11(11):3887-3895.（PD-1 基因的发现与鉴定）
2. Okazaki T, et al. Annu Rev Immunol. 2013;31:53-87.（PD-1 与免疫耐受的分子机制综述）
3. Topalian SL, et al. N Engl J Med. 2015;373(2):151-162.（PD-1 阻断在肿瘤免疫治疗中的临床应用）
4. Wherry EJ. Nat Immunol. 2011;12(6):492-499.（T 细胞耗竭的分子特征与 PD-1 的核心角色）
5. Francisco LM, et al. Immunol Rev. 2010;236:219-242.（PD-1 通路在自身免疫和外周耐受中的作用）
八、相关产品
肿瘤免疫 / 耗竭 T 细胞 Panel 常用搭配：
• 26-2279-12 AF647 Rat Anti-mouse PD-1 (RMP1-14) — 本页产品，耗竭 T 细胞标志物
• 12-2003-1 PE Rat Anti-mouse CD8a (53-6.7) — CD8+ T 细胞标记（PD-1 vs CD8 鉴定耗竭 CTL）
• 11-2004-12 FITC Rat Anti-mouse CD4 (GK1.5) — CD4+ T 细胞标记（TIL 中 CD4/CD8 亚群分析）
• 11-2008-1 FITC Rat Anti-mouse CD44 (IM7) — 活化/记忆 T 细胞标记（PD-1+CD44hi 耗竭表型）
配套试剂：
• NF0003 细胞染色缓冲液 ，流式染色专用
• NF0004-5 7-AAD 溶液 — 死细胞排除染料
九、常见问题 · FAQ
Q: 26-2279-12 的同型对照选什么？
A: 选择 AF647 标记的 Rat IgG2a, κ 同型抗体。RMP1-14 是 Rat IgG2a, κ 亚型，同型对照的宿主、亚型和偶联物需完全一致。
Q: PD-1 和 PD-L1 有什么区别？
A: PD-1（CD279）是受体，表达于活化的 T/B 细胞表面；PD-L1（B7-H1/CD274）和 PD-L2（B7-DC）是配体，表达于抗原提呈细胞（APC）和肿瘤细胞表面。PD-1 与 PD-L1/L2 结合后传递抑制信号，降低 T 细胞的活化、增殖和效应功能。在肿瘤微环境中，肿瘤细胞常高表达 PD-L1 以逃避免监视，阻断 PD-1/PD-L1 通路可恢复 T 细胞抗肿瘤活性。
Q: 正常小鼠脾细胞能检测到 PD-1 吗？
A: 正常未免疫小鼠脾脏中 PD-1+ T 细胞比例很低（通常 <5%），因为 PD-1 在静息 T 细胞上不表达，仅在 TCR 活化后短暂上调。如果要在正常脾细胞中观察 PD-1 表达，可通过体外 anti-CD3/anti-CD28 刺激 24-72 h 诱导上调。在肿瘤模型、慢性感染模型或自身免疫病模型中，T 细胞 PD-1 表达显著升高。
Q: RMP1-14 可以用于体内 PD-1 阻断实验吗？
A: 文献中 RMP1-14 已被报道可以阻断 PD-1 与其配体（PD-L1 和 PD-L2）的结合，并抑制巨噬细胞共刺激的 T 细胞增殖和细胞因子产生。26-2279-12 作为流式检测级产品，可用于体外染色检测 PD-1 表达；如需体内阻断实验，建议选用低内毒素/无叠氮化钠配方版本。
Q: 做肿瘤浸润淋巴细胞（TIL）分析怎么准备单细胞悬液？
A: 实体瘤组织需先机械剪碎后，用含胶原酶（Collagenase IV）和 DNase I 的消化液在 37℃ 消化 30-60 min，制成单细胞悬液。消化后经 70 µm 细胞筛过滤，红细胞裂解（推荐 Percoll 梯度离心或红细胞裂解液），用染色缓冲液重悬后按 Protocol 操作。注意消化条件过强可能破坏 PD-1 等表面分子表达，建议优化消化时间和酶浓度。
Q: PD-1 和 TIM-3/LAG-3/CTLA-4 可以一起检测吗？
A: 可以。多重耗竭标志物共表达分析是 T 细胞耗竭研究的标准方案。建议 Panel 搭配：AF647-PD-1 + PE-TIM-3 + FITC-CD8 + PerCP-LAG-3 等，注意各荧光素通道之间光谱溢出控制。PD-1+TIM-3+ 双阳性 T 细胞代表"深度耗竭"表型，功能缺陷最为严重。
十、技术支持
NeoMab 隶属信天翁生物科技（广州）有限公司，专注于流式抗体和免疫学试剂研发。
• 客服电话：400-090-1923
• 技术支持邮箱：service@gooniebio.com
• 公司官网：www.gooniebio.com
• 地址：广州市黄埔区瑞和路39号纳金科技园
页面总结：NeoMab 26-2279-12 AF647 Rat Anti-mouse CD279(PD-1) Antibody（RMP1-14），特异性识别小鼠 PD-1 分子（50-55 kDa），标记活化 T/B 细胞及耗竭 T 细胞（TIL），0.5 mg/mL 抗体浓度，≤1.0 µg/百万细胞推荐用量，Rat IgG2a,κ 亚型，AF647 红光（633 nm）激发发射 664 nm，RMP1-14 可阻断 PD-1 与配体结合，2-8℃ 避光保存两年有效，广泛用于肿瘤免疫检查点研究、T 细胞耗竭表型分析、PD-1/PD-L1 通路机制研究、肿瘤免疫治疗疗效评估等科研领域。
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