细胞凋亡检测结果怎么看？怎么圈门？小白必看
发布时间:2026-04-24
细胞为维持内环境稳态，由基因调控的自主有序死亡过程，与被动、无序的细胞坏死具有本质区别。在细胞凋亡早期，质膜内侧的磷脂酰丝氨酸(PS)会外翻至细胞膜表面；而在凋亡的中后期，一些较大分子的化合物可进入细胞将细胞核染上色（如PI/7-AAD）
Annexin-V：是一种Ca2+依赖性磷脂结合蛋白，能与磷脂酰丝氨酸（PS）特异性结合，因此可以作为早期凋亡的指标；核酸染料PI/7-AAD：可穿过细胞膜，嵌入 DNA 双链的碱基对之间实现结合，因此可以作为凋亡的中后期的指标。
FSC表示细胞大小，SSC表示细胞复杂程度
P1圈门：FCS和SSC圈出总细胞群
P2圈门：FSC-A和FSC-H圈出单细胞群，FSC-A和FSC-H表示的是细胞大小，H和A是成正比增大的
十字门：横纵标Annexin-V，纵坐标PI；双参数确定细胞凋亡时期
1.细胞自发荧光该怎么选择凋亡试剂盒？
如果细胞带自发荧光，空白对照和单阳对照需要用不带自发荧光的细胞，另外需要再增加一管带荧光但不加任何染料的细胞做单阳对照。
自发GFP绿光：Annexin V-APC/DAPI，Annexin V-APC/7-AAD
自发mcherry/RFP红光：Annexin V-APC/DAPI
2.为什么贴壁细胞消化的时候不能用含有EDTA的胰酶？
AnnexinⅤ具有Ca2+依赖性，而EDTA是一种钙离子螯合剂，会影响 AnnexinⅤ和PS的结合，导致假阴性结果。
3.染色较强和较弱？
Annexin V 单阳比例过高：Annexin V 孵育时间过长（超过 15 分钟）、缓冲液 pH / 钙浓度不对（Annexin V 依赖 Ca²+ 结合磷脂酰丝氨酸）
PI 染色阳性细胞过多：细胞通透性异常（如固定过度）、PI 孵育时温度过高（室温避光即可）、死细胞未去除（染色前应先离心弃上清）
荧光信号弱 / 无信号：抗体浓度过低、染色后洗涤过度（Annexin V 易被洗去）、荧光抗体失效（未避光保存）
4.对照要如何设置？只染两个指标是不是可以不用做单染管？
空白对照：无任何处理的细胞不染色直接上机（调节FSC和SSC的电压）
Annexin-V单阳/染管对照：活细胞均分成两份，一份不做处理，另一份55℃水浴孵育30min，两份混合后仅染Annexin-V
PI/7-AAD单阳/染管对照：细胞处理如上，混合后仅染。
PI/7-AAD阴性对照：无任何处理的细胞双染Annexin-V和PI/7-AAD阳性对照：55℃水浴孵育30min细胞双染Annexin-V和PI/7-AAD。
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