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qPCR中模板投入过少/过多有什么影响？别再大意
发布时间:2024-11-07
以信天翁的qPCR试剂盒为例，对于20 μL的反应体系，模板DNA的加入量应控制在1~2 μL（10~200 ng/20 μL）之间。
以信天翁的qPCR试剂盒为例，对于20 μL的反应体系，模板DNA的加入量应控制在1~2 μL（10~200 ng/20 μL）之间。
如果模板投入过少，可能会有以下影响
检测灵敏度降低：
模板DNA量不足可能导致荧光信号的累积低于检测阈值，使得qPCR仪器无法准确检测到扩增信号。
Ct值偏大：
模板量少意味着需要更多的循环次数才能达到阈值，导致CT值变大。
定量准确性受影响：
模板DNA量不足可能导致计算出的目的基因表达量不准确，影响实验结果的可靠性。
实验重复性差：
当模板DNA量不足时，实验对各种条件（如反应体系的组成、操作过程中的微小变化等）变得更加敏感，随机误差放大。这意味着即使是微小的实验条件变化，也可能对实验结果产生较大影响。
如果模板投入过多，可能会有以下影响：
Ct值偏小：
由于模板量充足，扩增达到检测阈值的循环数减少。
非特异性扩增增加：
高模板浓度可能增加非特异性结合，导致非目标序列的扩增。
抑制聚合酶活性：
过多模板可能消耗反应体系中的必需离子，如镁离子，抑制酶活性。
荧光信号干扰：
可能影响荧光染料的检测，比如荧光信号过强、背景噪音增加、荧光信号异常分布。
熔解曲线异常：
可能因非特异性扩增而导致熔解曲线出现多峰。
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