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什么东西会影响PCR？这里给总结全了

发布时间:2024-06-20

PCR是一个需要格外注意细节的实验，为什么PCR总是P不出来？这里给大家详细分析一些可能会影响PCR反应的因素，非常详细建议先收藏后看。

一

体系内部因素

DNA模板、引物、dNTPs、聚合酶以及缓冲液是PCR扩增的基础，如果它们出了异常，会对PCR扩增造成直接的影响。

①DNA模板

DNA模板是扩增的主要对象，原本提取出来的核酸浓度过低、纯度低、完整性差，很难让PCR顺利进行。

②引物

PCR的引物是单链DNA，主要的作用是为DNA聚合酶开始合成新的DNA链提供一个起点。引物设计建议遵从以下原则：

引物的长度：引物普遍要求在18-30个碱基为佳，过长不利于与模板结合，而且引物可能会形成二级结构，太短则可能会导致扩增特异性差。

注意避免出现4个以上连续的C或G，否则也可能会影响和模板的结合。如果目的序列比较保守，引物特异性差，可以适当延长引物的长度。

Melting Temperature 熔解温度 (Tm值)：理想溶解温度一般为55-60℃，退火温度需要低于Tm值。引物设计工具一般都会给出Tm值结果，也可以通过公式进行计算：Tm = 2(A+T) + 4(G+C)。

GC%:引物的GC%建议设定在45-60%。GC%与引物的溶解温度相关，GC%过高或过低都可能影响和模板的退火,如果含量太低，建议将引物的长度加长。

③dNTPs

dNTPs是合成新DNA链的原料，由腺嘌呤脱氧核苷酸、胞嘧啶脱氧核苷酸、鸟嘌呤脱氧核苷酸、胸苷脱氧核苷酸构成，每种dNTP浓度应保持相同，错配或者整体浓度过低，会对PCR产量造成直接影响。

④DNA聚合酶

在引物的辅助下，DNA聚合酶可以招募核苷酸按照5'到3'端方向延伸核酸链。如果聚合酶的浓度过低，可能会导致PCR产物变少，如果浓度过高，又可能会引起非特异扩增。

⑤缓冲液

缓冲液的作用是维持PH值稳定，保护DNA聚合酶的活性和扩增效率。需要注意Mg2+的浓度，浓度过低，可能会降低DNA聚合酶的活性，导致PCR产物减少。而浓度过高，又可能会非特异性扩增。

⑥PCR程序设定

PCR的步骤主要有三步，变性让DNA双链解开，退火促进引物与模板结合，延伸完成新链合成，需要控制好各个步骤的温度、时间、循环次数的设置。

变性步骤：此阶段DNA双链在高温下解开，形成单链。如果模板DNA的GC含量较高，那么双链间的氢键更为稳定，建议适当延长变性时间，保证双链完全解开。

退火步骤：在此阶段引物与DNA单链结合。如果引物碱基数较少，适当提高退火温度，以便于提高PCR的特异性；反之，如果碱基数较多，退火温度可以适当降低，促进引物与DNA模板的结合。

延伸步骤：在DNA聚合酶的作用下，新的DNA链得以合成。如果产物长度较长，建议相应延长延伸时间，促进新链的完整合成。

循环次数：循环次数的选择主要取决于初始模板DNA的浓度。一般来说，循环次数越多，DNA的扩增量越大，但也可能导致非特异性产物的增加和碱基错配率的上升。因此，在设定循环次数时，需综合考虑实验目的、模板浓度及产物质量等因素，以达到理想的扩增效果。

二

PCR反应体系外部因素：

在PCR反应体系外，如果人为故意添加或者意外添加某些物质，可能会增强/抑制PCR的反应

增强剂：

DNA模板、引物、dNTPs、聚合酶以及缓冲液是PCR扩增的5个要素，但是有时候，因为样本质量、目标序列的特殊性以及实验条件等因素，可能需要使用增强剂来以提高PCR的特异性、效率以及产量。

增强剂大致可以分为以下类型：

激活剂：增强聚合酶活性，促进反应进行。例如，牛血清白蛋白（BSA）在某些情况下能提高聚合酶的稳定性和活性。

保护剂：维护模板DNA完整性，防止降解。例如，T4基因32蛋白可保护单链DNA不受核酸酶攻击。

增效剂：增强引物与模板的结合，提高扩增特异性。例如，二甲基亚砜（DMSO）有助于解决模板二级结构带来的扩增难题。

促进剂：填补反应体系空隙，为聚合酶提供适宜环境。例如，甘油或甲酰胺可作为促进剂使用，尤其适用于困难扩增的情况。

净化剂：清除可能干扰反应的杂质。例如，特定的蛋白酶抑制剂可防止蛋白酶干扰PCR反应。

调节剂：微调反应参数，如离子浓度。例如，适当调整Mg 2+浓度能显著影响PCR的特异性和产量。

链接剂：加强引物与模板的连接。例如，特定的寡核苷酸可作为“锁式探针”，辅助扩增反应进行。

抑制剂：

在PCR过程中，有时候会出现非特异性扩增或者假阳性结果，可能会干扰到实验结果的准确性，可以使用PCR抑制剂。

以下是PCR常见的抑制剂：

SDS（十二烷基硫酸钠）：作为离子去污剂，0.005%的浓度能显著降低产物的生成，达到0.01%的浓度能完全抑制PCR反应。

苯酚：0.2%的浓度能显著降低产物的产量，达到0.5%的浓度足以完全抑制PCR反应。

乙醇：一般浓度大于1%时可抑制PCR反应，但在某些体系中可能会增加产物的产量，

异丙醇：其抑制作用略强于乙醇。

乙酸钠：浓度大于5mM时可抑制PCR反应。

氯化钠：浓度大于25mM时可抑制PCR反应（但生理盐水中无影响）。

EDTA：0.5mM的浓度能减少PCR产物，1mM的浓度则完全抑制PCR产物的生成，所以需要注意，不要超过这这浓度。

血红素（heme）：来源于血液，浓度大于1mg/ml时可抑制PCR反应。

氯高铁血红素（hemin）：浓度大于0.1ng/μl时可抑制PCR反应。

丹宁酸（tannic acids）：浓度大于0.1ng/μl时可抑制PCR反应。

肝素：浓度大于0.15IU/ml时可抑制PCR反应。

此外，还有其他抑制剂，如尿素（来源于尿，浓度大于20mM时产生抑制）、腐殖质（来源于土壤、植物材料）、植物多糖（来源于粪便、植物）、聚苯乙烯、聚丙烯（来源于紫外线照射塑料管）、胆酸盐（来源于粪便）、胶原质（来源于组织）、靛青染料（来源于粗斜纹棉布、牛仔裤）、蛋白酶（来源于牛奶）、钙离子（来源于牛奶、骨头）、铁离子（来源于血液）等。

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