RNAflash™ DCA 2-step RT qPCR （probe）kit
免提RNA，高通量qPCR检测神器
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产品简介
RNAflash DCA（Direct Cellular Amplification）two steps RT qPCR （probe）kit 是一款快速、高效地从“细胞”直接到“扩增结果”的 全套试剂盒，适用于 10 - 105 个培养细胞的基因表达分析。本产品无需传统提取繁琐的流程，可在细胞培养板中直接完成基因组 DNA 清除和RNA 获取；搭配高效率、高稳定性、高特异性的逆转录试剂和探针法qPCR 试剂，快至 82 min 即可从细胞中得到基因表达结果。本试剂盒操作便捷，可兼容广泛的细胞类型(贴壁和悬浮细胞)及细胞量，在提高效率的同时减少纯化过程中的样品损失，也可解决传统提取方式中低细胞数提取效果不佳的问题。本试剂盒可用于高通量(96/384 孔板)细胞 RNA 的表达分析。
产品特点
普适性：多种细胞类型的基因表达分析，从 10 个到 10⁵个常规培养细胞或稀有细胞，均可实现有效检测；
免纯化工艺：简化传统 RNA 提取流程，在培养孔内 5 分钟完成细胞裂解，7 分钟内完成 gDNA 消化，避免纯化造成的 RNA 损失；
高通量兼容：满足大规模细胞样本的平行处理需求，显著降低了高通量检测过程中的时间成本以及操作误差；
高效率：优化的逆转录体系兼容裂解体系，qPCR 体系可对生成的 cDNA 精准检测，最快检测仅需 50min。自备材料和试剂
ROX 校正染料 ， 1 × PBS 缓冲液 、RNase-free ddH2O 、RNase-free 吸头 、 1.5 ml RNase-free 离心管 、0.2 ml RNase-free 八联排/PCR 管等。
实验工作流程图
实验流程
RNA获取
样本处理与准备
l 贴壁细胞：
(a) 洗涤细胞：将不同孔板的贴壁细胞轻轻去除细胞培养基后，贴壁缓慢加入对应量的胰酶，37℃培养箱消化3-5 min ，并在显微镜下观察细胞形态。当细胞开始变圆、细胞间隙变大时，说明消化接近完成，随后加入适量的含血清培养基终止消化作用，轻轻吹打细胞，使细胞脱落并形成单细胞悬液，1000 rpm (930 × g) ， 4℃离心5 min ，移除培养基后，等体积的预冷的1×PBS洗涤，1000
rpm (930 × g) ， 4℃离心5 min收集至管底，加入适量PBS（细胞数量测试的线性范围为10至105个） , 置于冰上备用。
注意1：去除培养基或PBS时动作应尽量轻缓 ，避免在清洗过程中造成细胞损失。
注意2：若贴壁细胞为96孔或者384孔板培养 ，则去除培养基后直接用预冷PBS洗涤2-3次即可；若贴壁细胞使用其他容器培养 ，则需用胰蛋白酶将贴壁细胞从容器壁解离下来 ，并对胰蛋白酶失活处理 ，可加入适量的含血清的完全培养基中和胰蛋白酶 ，离心去除培养基后，预冷PBS连续洗涤细胞2-3次。
(b) 稀释细胞：根据实验需求(细胞数量测试的线性范围为10至105个) ，用预冷的1 × PBS稀释细胞，将稀释后的细胞悬液分装至200 μL PCR管中，每管5 μl (保持细胞数在10 - 105个/管) ，置于冰上备用。
l 悬浮细胞：
(c) 去除培养基：将悬浮细胞转移至离心管中，1000 rpm (930 × g) ， 4℃离心5 min收集至管底， 去除培养基。
(d) 洗涤细胞：加入预冷的1 × PBS (尽量保证细胞密度处于2 ×104至2 ×106个/mL, 500 μL中含103个细胞至105个细胞) ，用移液器轻轻吸打8 - 10次，无明显细胞团即可；1000 rpm (930 × g) ，4℃离心5 min收集至管底，去除PBS。
(a) 稀释细胞：根据实验需求(细胞数量测试的线性范围为10至105个) ，用预冷的1 × PBS稀释细胞，将稀释后的细胞悬液分装至200 μL PCR管中，每管5 μl (保持细胞数在10 - 105个/管) ，置于冰上备用。
注意 ：去除培养基或PBS时动作应尽量轻缓 ，避免在清洗过程中造成细胞损失。
RNA获取
(a) 配制裂解工作液(200 μL PCR管)
组份 体积 (μL） Lyse™ Buffer 48 Purge™ Enzyme 2 注意 ：裂解工作液按照孔板所需体积进行配制 ，各组分的比例为Lyse™ Buffer : DNase I : Purge™ Enzyme = 24 : 1。 配制完毕 ，颠倒混匀10 - 15次 ，避免剧烈涡旋振荡；混匀后置于冰上 ，请在1 h内使用。
(b) 向含有细胞的96孔板中加入50 μL裂解工作液，移液器轻轻吸打8 - 10次充分混匀，室温静置5-7 min 裂解细胞。
(c) 加入5 μL StopXtract™ Buffer ，移液器轻轻吸打8 - 10次混匀，室温静置2 min终止反应。
注意 ： 裂解产物可置于冰上保存2 h ，若需长期保存需置于-80℃。
逆转录反应
配置反应体系
按下表 1 在冰上配制反应体系 , 使用 5 μL RNase-Free/ Nuclease Free H2O 作为无模板对照 （NTC 组），每组设置 3 个重复。随后按照表 2 程序进行反应，即逆转录： 50℃反应 20 min ，酶失活：85℃反应 5 min。反应完的产物若立即使用则置于冰上保存，若间隔一段时间使用，则置于-20℃保存。
表 1 逆转录反应体系
试剂 单个反应体积(μL)（1） 单个反应体积(μL)（1） DCART Enzyme Mix 1.75 3.5 DCART Buffer Mix 3.25 6.5 细胞裂解液(2) X X RNase-Free/DNase-Free 水 Up to 10 μL Up to 20 μL 注意 ：1. 将各组分置于冰上融解 ，轻微混匀离心后 ，加液顺序按照体系从多到少。
2. 一般 20 μL 体系投入 4 μL 细胞裂解液。可按照基因表达丰度自行调整 ，最多不超过 8 μL ，细胞裂解液投入体积尽量不要低于 1 μL ，避免吸液不准造成的误差
表 2 逆转录反应程序
步骤 循环数 反应温度 反应时间 逆转录(3) 1 cycle 50℃ 20 min 变性 85℃ 5 min 注意 ：3. 逆转录时间可根据模板的起始量或者基因丰度适度延长 ，最长反应时间不超过 30 min。
qPCR反应
配置反应体系
按下表 3 在冰上配制反应体系
表 3 DCAqPCR （probe）反应体系
试剂 单个反应体积(μL)（4） DCAqPCR probe Mix 10 10 µM 靶标上游引物（5,6,7） 0.4 10 µM 靶标下游引物（5,6,7） 0.4 10 µM 靶标探针（8） 0.2 cDNA 模板 X（参考步骤 7.3.2） ROX 校正染料（9） Y RNase-Free/DNase-Free 水 Up to 20 μL 注意 ：4. 将各组分置于冰上融解 ，轻微混匀离心后 ，加液顺序按照体系从多到少。
5. 一般来说反应体系中引物终浓度为 0.2 μM 即可得到较好的扩增效果。 当反应性能比较差时 ，可以在 0.1 - 1.0 μM 范围内调整引物浓度。
6. 可根据检测需要 ，增加靶标个数。
7. 扩增产物长度请选择在 100 - 500 bp 范围内 ，尤其推荐 100 - 200 bp 之内。
8. 一般来说反应体系中探针终浓度为 0.1 μM 即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时 ，可在 0.05 – 0.25 μM 范围内调整其浓度。
9. 若使用需要校正染料的 qPCR 仪 ，则按照注意事项中建议的浓度投入到体系。
模板投入
向实验组的 PCR 反应管中分别加入 2-4 μL 细胞裂解液，使用 5 μL RNase-Free/ Nuclease Free H2O 作为无模板对照 （NTC 组），每组设置 3 个重复。
注意 ：投入 2-8μL 细胞裂解液 ，对扩增无抑制作用 ，细胞裂解液投入体积尽量不要低于 1 μL ，避免吸液不准造成的误差。
反应程序
将反应体系轻轻混匀，并短暂离心，随后运行表 2 程序。
表 2 DCAqPCR （probe）反应程序
步骤 循环数 反应温度 反应时间 收集信号 预变性 1 cycle 95℃ 30 sec 否 变性 40 cycle
95℃ 10 sec 否 延伸 60℃ 30 sec 是 No RT Control 反应(可选)
No RT Control 是指不加逆转录酶的逆转录阴性对照反应，用于检验 RNA 模板中是否有基因组 DNA残留。也可使用 DCA qPCR probe Mix（货号 500-106-6）进行检测。
仪器 无需添加ROX
(Bio-Rad) IQ5, CFX96, CFX384, CFX Connect, MJOpticon, Opticon 2;
(Cepheid) SmartCycler®System, Smart Cycler II System;
(Roche) LightCycler®2.0, 480, 96;
(Qiagen) Rotor-Gene Q, 3000, 6000;
(Bioer) Line-Gene;
(Eppendorf) Mastercycler ep realplex;
(Analytik Jena) qTOWER3;
添加ROX
（终浓度为0.4μM)
(Thermo) ABI7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast, StepOne, StepOnePlus
添加ROX
（终浓度为0.08μM）
(Thermo) ABI 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 / 5, QuantStudio 6 / 7 / 12K Flex,
QuantStudioTMDx;
(Agilent) Mx3000P, Mx3005P, MX4000;
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产品组成
货号 组分 规格（100T/20 μL） 说明 储存条件 500-106-1 Lyse™ Buffer(a) 250µL/支 裂解缓冲液 融解置于2-8℃ 500-106-2 Purge™ Enzyme 100µL/支 基因组去除酶 -20℃ 500-106-3 StopXtract™ Buffer(b) 250µL/支 终止缓冲液 分装置于-20℃ 500-106-4 DCA RT Enzyme Mix(c) 175µL/支 酶混合液 -20℃ 500-106-5 DCA RT buffer Mix(c) 325µL/支 缓冲液混合液 -20℃ 500-106-6 DCA qPCR probe Mix(d) 1000µL/支 定量混合液 -20℃ a. Lyse™ Buffer解冻后可于2 ~ 8℃条件下稳定存放1年。
b. StopXtract™ Buffer应避免反复冻融 ，需分装后置于-20℃。
c. DCA RT Mix含dNTP Mix ，Mg2+ ，逆转录酶、oligo d(T)18 ，随机引物和辅助因子等 ，该组分需严格按照规定温度保存 ，且逆转录时无需再添加特异性引物。
d. DCA qPCR probe Mix中含有热启动Taq酶、 UDG ，dUNTPs等 ，需按规定储存条件储存。
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注意事项:
1.按照注明的储存条件和要求对试剂储存，比如为避免StopXtract™Buffer反复冻融，应对其分装后置于-20℃。
2. 裂解细胞时，吹打时尽量轻柔，避免剧烈起泡。
3. DCA RT Enzyme Mix含有高浓度的甘油，使用前请短暂离心，收集到反应管底部，并用移液枪轻轻吸打，
充分混匀后准确吸取。
4. 反应液的配制请使用RNase-free枪头，EP管等，尽量避免污染。
5. 本制品中未配有ROX Reference Dye ，如果反应中需要添加ROX Reference Dye用以校正孔间荧光信号值误差，
请根据仪器设备说明书要求确定是否添加ROX Reference Dye（一般需要高浓度ROX校正的仪器的ROX工作浓度为0.4 μM；需要低浓度ROX校正的工作浓度为0.08 μM ,仪器见表3），ROX Reference Dye 产品在反应体系中建议50X稀释使用（例如，50μl反应体系中添加1μl ROX Reference Dye），如果实验结果不理想，可调整ROX Reference Dye添加量。
关键词
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