1-step RT-qPCR (Probe) kit
1次上机完成逆转录、qPCR，45分钟获取ct值
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产品简介
一步法 RT-qPCR (探针法)试剂盒产品，专为以 RNA 为模板(如 RNA 病毒)的定量 PCR 检测而设计。使用基因特异引物(GSP) ，逆转录和PCR 反应在一管内完成，不需要额外的开管/移液操作，大大提高了检测通量，并降低了污染的风险。可实现单管单重或多重荧光抗体版 RT-qPCR 快速反应，并能有效防止污染。试剂盒包含了性能优异的逆转录酶、热启动 Taq DNA 聚合酶和优化的缓冲液成分，只需要加入引物/探针和 RNA 即可进行反应。
产品特点
本产品广泛用于动物、植物、微生物(病毒等)的各种 RNA 类核酸检测；
本产品在单管内完成反转录与 qPCR 反应，简化操作， 提高效率，可有效的降低多次操作污染的可能性。
独特的酶组合，确保反应的高特异性和高灵敏度可达 10 fg；
经过优化的缓冲体系确保高效的逆转录和扩增过程。使用说明
1 、 按下表 1 在冰上配制反应体系
表 1 一步法 RT-qPCR (探针法)试剂盒反应体系
试剂 单个反应体积(μL)（ 1 ） 一步法 RT-qPCR(探针法)反应缓冲液 10 一步法 RT-qPCR(探针法)酶反应液 1 10 µM 靶标上游引物（2,3,4） 0.4 10 µM 靶标下游引物 0.4 10 µM 靶标探针 0.2 ROX 校正染料（5） X RNase-Free/DNase-Free 水 Up to 15 μL 注意：1. 将各组分置于冰上融解，轻微混匀离心后，加液顺序按照体系从多到少。
2. 一般来说反应体系中引物终浓度为 0.2 μM 即可得到较好的扩增效果。当反应性能比较差时，可以在 0.1 - 1.0 μM 范围内调整引物浓度 ;此外引物探针摩尔浓度比例一般使用2：1,也可根据引物探针效果自行调整。
3.可根据检测需要，选择适当的荧光通道，增加靶标个数。
4.扩增产物长度请选择在 100 - 500 bp 范围内，尤其推荐 100 - 200 bp 之内。
5.（需自备）若使用需要校正染料的qPCR 仪，则按照注意事项中建议的浓度投入到体系。
2 、向实验组的 PCR 反应管中分别加入 5 μL 阳性 RNA 样本(10 fg-100 ng) ，使用 5 μLRNase-Free/ Nuclease Free H2O 作为无模板对照 （NTC 组），每组设置 3 个重复。
注：模板投入量最好在 10 pg-1 ng，投入量过高可能对扩增有抑制，过低将导致结果不稳定。
3 、将反应体系轻轻混匀，并短暂离心，随后运行表 2 程序。
表 2 一步法 RT-qPCR (探针法)试剂盒反应程序
步骤 循环数 反应温度 反应时间 收集信号 逆转录(6) 1 cycle 50℃ 3 min 否 预变性 1 cycle 95℃ 30 sec 否 变性 40 cycle
95℃ 10 sec 否 延伸 60℃ 30 sec 是 注：6. 对于具有复杂二级结构或高GC区域的模板，将逆转录温度提高到55℃ , 有助于提高扩增效率和灵敏度。逆转录时间可延长至15 min，有助于提高cDNA产量。
仪器 无需添加ROX
(Bio-Rad) IQ5, CFX96, CFX384, CFX Connect, MJOpticon, Opticon 2;
(Cepheid) SmartCycler®System, Smart Cycler II System;
(Roche) LightCycler®2.0, 480, 96;
(Qiagen) Rotor-Gene Q, 3000, 6000;
(Bioer) Line-Gene;
(Eppendorf) Mastercycler ep realplex;
(Analytik Jena) qTOWER3;
添加ROX
（终浓度为0.4μM)
(Thermo) ABI7000, 7300, 7700, 7900, 7900HT, 7900HT Fast, StepOne, StepOnePlus
添加ROX
（终浓度为0.08μM）
(Thermo) ABI 7500, 7500 Fast, ViiA7, QuantStudio 3 / 5, QuantStudio 6 / 7 / 12K
Flex, QuantStudioTMDx;
(Agilent) Mx3000P, Mx3005P, MX4000;
-
产品组成
货号 组分 规格（100T/20 μL） 说明 500-108-1 一步法RT-qPCR反应缓冲液(探针法) 1000µL/支 反应缓冲液预混液 500-108-2 一步法RT-qPCR酶反应液(探针法) 100µL/支 酶预混液 -
注意事项
1. 一步法 RT-qPCR(探针法)酶反应液含有高浓度的甘油，使用前请短暂离心，收集到反应管底部，并用移液枪轻轻吸打，充分混匀后准 确吸取。
2. 反应液的配制请使用RNase-free 枪头，EP 管等，尽量避免污染。
3. 本制品中未配有 ROX Reference Dye ，如果反应中需要添加 ROX Reference Dye 用以校 正孔间荧光信号值误差，请根据仪器设备说明书要求确定是否添加 ROX Reference Dye（一般需要高浓度 ROX 校正的仪器的 ROX 工作浓度为 0.4 μM；需要低浓度 ROX 校正的工作浓度为 0.08 μM ,仪器见表 3），ROX Reference Dye 产品在反应体系中建议 50X 稀释使用（例如，50μl 反应体系中添加 1 μl ROX Reference Dye），如果实验结果不理想，可调整 ROX Reference Dye 添加量。
关键词
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