如何判断qPCR的数据能不能使用？看这3点就够了
发布时间:2024-07-01
qPCR即通过PCR扩增反应中每一个循环产物荧光信号的实时检测，从而实现对起始模板定量及定性的分析。那么忙活了一两天，好不容易做完了qPCR，如何才能判断数据能不能用呢？教大家从三个方面来判断。
省流版答案：
1、Ct值12~182、
2、熔解曲线:
①TM值在80-90之间
②单峰无杂峰，且尖锐
③峰距在5个TM内最优
3、扩增曲线:
①曲线具有平台期
②Fluorescence至少在3以上
③曲线无二次抬头
一、看Ct值范围是否理想
Ct值是指阈值循环数，C代表Cycle（循环），t代表threshold（阈限）。
在PCR（聚合酶链式反应）检测中，DNA的复制都需要经过多个循环，每一个循环都会产生新的DNA。
而这个荧光信号，其实就是在每一个循环中，随着DNA的复制数量增加，其积累到一定程度时所发出的信号。这个信号会随着循环的增加而增强，直到达到设定的阈值，这个阈值就是阈限。
数据的代表含义：
如果一个样本中目的基因片段的浓度越高，那么在同样的时间内，DNA复制的数量就会越多，荧光信号达到阈值所需的循环数就越少。反之，如果目的基因的浓度越低，那么所需的循环数就会越多。
因此，通过Ct值的大小，我们就可以大致判断出被测样本中目的基因的浓度高低。
简单地来说，Ct值可以用来判断目标基因的有无及多少，Ct值越小，就代表被测样本中目的基因片段的浓度越高。
Ct值最好落在12~18左右的范围内。那么Ct值不在理想范围内怎么办？
Ct值过小原因分析：
①模板浓度过高
措施：可以减少模板cDNA量，或者使用更高比例的cDNA进行稀释。
②引物设计不合理。
措施：优化引物设计，提高扩增效率和特异性。
Ct值过大原因分析：
①模板浓度低或存在PCR抑制物。
措施：模板cDNA量不足或者在提取过程中受到污染，导致模板质量较差。可以尝试提高模板浓度，或者提高RNA或cDNA的稀释比例，重新制备模板等。
②扩增效率低。
措施：
引物设计不合理、退火温度过高、反应程序不优化、试剂质量差等原因导致的扩增效率低，可以尝试降低退火温度、选用二步法扩增、确保组分和体系充分混匀、优化反应程序，或尝试更换试剂等方法。
二、看熔解曲线是否理想
荧光染料SYBR Green能够与DNA双链结合并发出荧光信号，在qPCR的扩增过程中，DNA双链经过多次复制，产生大量的扩增产物，此时荧光信号最强。
当扩增结束后，温度慢慢高，DNA双链逐渐解离为单链。随着DNA双链的解离，荧光值会慢慢下降。尤其是到了DNA 解链50%的温度时，SYBR Green 会大量游离出来，荧光信号急剧下降，一直到0。
简单地说，DNA双链解离导致的荧光值变化，就是熔解曲线。
但是大家常见的熔解曲线是不是不符合上述描述？其实这是为了方便观察，大家最常见的图谱，其实是熔解曲线的导数图谱。
熔解曲线横坐标取温度，而纵坐标则取荧光信号变化的负一次导数（dR/dT）。这样，在熔解曲线上会出现一个熔解温度（Tm）的特征峰，也就是DNA双链解链50%时所需的温度。
（导数图谱）
溶解曲线的原始图谱，线条就像瀑布一样从倾斜的山坡上飞流直下，然后躺平平流。
（原始图谱）
曲线代表的含义：
通过观察熔解曲线，可以分析是否存在非特异性产物、引物二聚体、杂质等。综合来看，理想的熔解曲线（导数图谱）应该具备以下3个特征：
1、TM值在80-90之间
2、单峰无杂峰，且尖锐
3、峰距在5个TM内最优。
奇形怪状的熔解曲线展示：
异常单峰：
①单峰，但不尖锐
可能存在的问题：存在大小相近的非特异性产物。
措施：
使用高分辨率的电泳进行确认，若存在非特异性产物，建议重新设计引物。
②单峰但在80℃前
原因分析：产物中可能存在引物二聚体。
措施：重新设计引物，检查是否有加入模板。
异常双峰：
①双峰，较低峰Tm在80℃之前
原因分析：产物中可能存在引物二聚体。
措施：提高退火温度、降低引物浓度、重新设计引物等。
②双峰，较低峰Tm在80℃之后
原因分析：有非特异性扩增，可能是模板中有基因组DNA污染或者基因存在多个转录变体。
措施：重新设计引物或者去除基因组DNA。
三、看扩增曲线质量是否理想
扩增曲线是指扩增过程中产物量随循环次数变化情况的图表，线条呈 “S”型，分为基线期、指数扩增期、线性扩增期、平台期。
综合来看，理想的扩增曲线应具备以下3个特征：
1、曲线具有平台期
2、Fluorescence至少在3以上
2、曲线无二次抬头
异常扩增曲线分析：
①扩增曲线线性图无法到达平台期
原因分析：循环数设置太少、试剂扩增效率低
措施：增加循环数，更换效力更强的酶。
②扩增曲线线性图平台期“低头”
原因分析：基线范围选择不对，基线终点大于曲线对应的Ct值。
措施：减少基线期终点，再重新做数据分析。
③扩增曲线重复性差
原因分析：反应液试剂没有混匀、加样量误差大、仪器未使用ROX校正又或者基因本身丰度低/模板浓度低。
措施：保证反应液彻底震荡或者吹打混匀，矫正移液枪，采用二档吸液一档出液的方式，加样时可以先加大体积再加小体积。如果是基因丰度低或者模板浓度低，可以增加复孔的数量，最后舍弃1~2个偏差比较大的数据。
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