从人全血中制备多形核细胞的操作步骤
发布时间:2026-06-29
方法：密度梯度离心联合氯化铵裂解
一、实验目的
建立从人抗凝全血中分离多形核细胞（即粒细胞群体）的标准化流程。该方法利用密度梯度离心实现初步富集，再借助氯化铵对红细胞的选择性裂解特性进一步去除红细胞干扰，最终获得适用于下游功能实验的高活性粒细胞悬液。
二、材料与试剂
- 生物样本：新鲜采集的人抗凝全血（推荐使用肝素钠或枸橼酸钠作为抗凝剂）。
- 核心试剂：
- 人淋巴细胞分离液（密度1.077 g/mL，广州信天翁生物 货号100-306）。
- 含2%胎牛血清的磷酸盐缓冲液（PBS），作为样本稀释液和细胞洗涤液（广州信天翁生物 货号140-2001）。
- 无菌氯化铵红细胞裂解液（广州信天翁生物 货号100-300）。
- 耗材与设备：无菌离心管、一次性移液管、配备水平转子的离心机（支持缓加速和缓减速模式）。
三、详细操作步骤
1. 样本稀释
取抗凝全血，按1:1的体积比例与含2%胎牛血清的PBS在离心管中混合，用移液管轻柔吹打数次。
2. 密度梯度叠加
另取一支洁净的无菌离心管，先加入与稀释后全血等体积的人淋巴细胞分离液。随后将稀释后的全血缓慢叠加于分离液上层——操作时将移液管出口抵住离心管内壁，让血液沿管壁缓缓流下，避免冲击分离液液面，确保两层液体之间形成清晰的界面。
3. 梯度离心
将离心管对称配平后放入水平转子，于室温条件下以 800 × g 离心 20分钟。注意：离心机需启用低加速和低减速模式（即关闭刹车），以保持梯度界面的稳定性。
4. 收集粒细胞沉淀
离心结束后，管内自顶部至底部分为四层：血浆层（最上层）、白膜层（含单个核细胞）、分离液层（透明介质）和细胞沉淀层（底部，含红细胞与粒细胞）。操作时用移液管从上层开始依次吸弃血浆层、白膜层和分离液层，仅保留管底部呈现为红色的细胞混合沉淀。
5. 氯化铵裂解处理
向保留的细胞沉淀中加入足量氯化铵裂解液，以加满离心管为宜，确保沉淀被完全覆盖并重悬。将离心管置于冰上孵育 10分钟，期间可轻轻摇动一至两次以促进红细胞充分裂解。
6. 洗涤与收获
- 裂解完成后，于室温下以 500 × g 离心 10分钟（同样采用缓加速、缓减速设置），离心后弃去红色的上清液。
- 加入含2%胎牛血清的PBS重悬沉淀，以 120 × g 室温离心 10分钟，离心设置同前，弃上清。
- 末次离心完成后，根据后续实验设计，用适量完全培养基或PBS重悬最终的细胞沉淀，即为富集的多形核细胞悬液。
四、关键质控点
- 血液新鲜度：建议优先使用采血后8小时以内处理的全血，超出此窗口期细胞活率可能明显下降。
- 温度平衡：除氯化铵裂解液需预冷至4℃外，其余所有试剂使用前均需恢复至室温（18-22℃），温度偏差可能影响分层效果和细胞活性。
- 离心设置：800 × g 配合缓加速、缓减速是粒细胞与单个核细胞实现有效分离的前提条件，不推荐随意调整该参数。
- 裂解时间控制：冰上孵育严格限定在10分钟，超出15分钟粒细胞损伤风险将显著升高。
科研高频FAQ
问：密度梯度离心后，为什么粒细胞会沉在管底而不是停留在分离液层中？
这取决于细胞的浮力密度差异。人淋巴细胞分离液的密度为1.077 g/mL，单个核细胞（淋巴细胞、单核细胞）的密度低于此值，因此悬浮于分离液上层界面；而粒细胞和红细胞的密度均高于1.077 g/mL，在离心力作用下会穿过分离液层沉降到管底。这一物理分层逻辑是密度梯度离心法的核心原理。
问：实验前为什么要将除裂解液外的所有试剂恢复至室温？
温度会影响液体密度和黏度，进而改变细胞在梯度介质中的沉降行为。室温条件下分离液的密度参数经过精确标定，温度偏离可能导致分层界面偏移或细胞回收率下降。裂解液预冷则是为了减缓裂解反应速率，使红细胞在可控条件下充分裂解同时保护粒细胞活性。
问：氯化铵裂解红细胞的选择性原理是什么？
氯化铵通过铵离子进入细胞后改变胞内pH平衡来发挥裂解作用。红细胞对氯化铵的渗透敏感性显著高于粒细胞——前者缺乏足够的离子转运缓冲能力，铵离子在胞内快速累积导致渗透压失衡和细胞膜破裂；而粒细胞的离子调控机制更完善，在短时冰上孵育条件下能够维持细胞完整性。这种选择性差异正是氯化铵用于红细胞清除而不显著损伤粒细胞的化学基础。
问：120 × g末次低速洗涤步骤的作用是什么？
该步骤并非为了去除红细胞，而是用于清除残留的血小板和细胞碎片。血小板体积小、密度低，在较高离心力（如500 × g）下会被连带沉淀，而120 × g的低速离心可使血小板保留在上清液中，在弃去上清时被带走，从而获得更纯净的粒细胞悬液——这对后续的细胞分选和培养环节具有积极意义。
问：分离后的粒细胞是否可以冻存备用？
建议新鲜使用。粒细胞属于终末分化细胞，对冻存-复苏过程的耐受性较差，复苏后活率和功能活性通常会显著下降。
问：如何评估制备得到的多形核细胞的纯度和活性？
答：建议采用以下方法进行双重评估。纯度评估方面，取少量细胞悬液制作涂片，进行瑞氏-吉姆萨染色，在显微镜下计数200个细胞，计算粒细胞（分叶核中性粒细胞为主）所占百分比。活性评估方面，使用台盼蓝染色法，取等体积细胞悬液与0.4%台盼蓝混合，在计数板上计数蓝染细胞（死细胞）与未染色细胞（活细胞），活细胞比例应不低于90%。
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