如何冻存PBMC？从细胞冻存到复苏后分选的标准操作流程 | FiniGet分必得®免疫磁珠分选技术

Q: 复苏后的PBMC如何评估是否适合进行后续分选实验？

复苏后建议先取样进行细胞计数和台盼蓝染色活率检测，活率高于80%通常认为可正常使用。若后续计划使用FiniGet分必得®无柱阴性分选试剂盒进行免疫磁珠分选，还需注意细胞悬液中是否存在明显团块或死细胞过多。

发布时间:2026-07-16

本文详解10% DMSO/90% FBS冻存体系、梯度降温操作及液氮长期保存要点，并介绍冻存复苏后使用FiniGet分必得®无柱阴性分选试剂盒进行免疫磁珠分选的注意事项。

在免疫学与细胞治疗研究中，外周血单个核细胞（PBMC）的冻存与复苏是一项基础而关键的操作。能否在长期保存后依然获得高活率、高功能性的细胞，直接关系到后续T细胞分选、T细胞激活、单细胞测序乃至CAR-T构建等实验的顺利开展。对于使用FiniGet 分必得®无柱分选试剂盒（信天翁生物）进行后续免疫磁珠分选的研究者来说，从冻存环节开始做好每一步控制，是保障后续实验顺利进行的重要前提。

下面介绍一套常用的PBMC冻存方案——以含10% DMSO和90% FBS的体系为核心，配合梯度降温与液氮长期保存。

一、PBMC冻存前的准备工作

正式操作开始前，需要做好两项准备。第一，所有即将接触细胞的试剂均需预先置于冰上充分冷却，低温环境是保护细胞免受DMSO毒性损伤的第一道防线。第二，如果实验室对使用动物来源血清存在安全性顾虑，可选用不含血清及动物成分的商品化冻存液作为替代方案，但需注意不同冻存体系的细胞密度适用范围可能存在差异。可以使用信天翁无血清冻存液，货号100-401。

二、冻存液配制与细胞处理

在冻存液配制环节，建议提前制备足量的含20% DMSO的FBS溶液，并始终保存在冰上备用。这里需要特别留意一个操作细节：100%浓度的DMSO切勿直接置于冰上，否则会因低温结冰。

细胞样本的处理同样讲究。首先确保待冻存的PBMCs已充分重悬为单细胞悬液，没有肉眼可见的团块。随后以300 × g的离心力离心10分钟，使细胞形成紧实的沉淀。去除上清时，建议用移液器小心吸弃液体，并在管底保留极少量残留液，以防误吸细胞沉淀造成不必要的损失。

完成洗涤后，需用预冷的FBS将PBMCs重悬至适当密度——推荐范围为每毫升1 × 10⁶至20 × 10⁶个细胞，冰上放置待用。接下来进入关键的混合步骤：将细胞悬液与之前配好的含20% DMSO的FBS溶液按等体积比例（1:1）混合。混合后的最终体系中，DMSO终浓度为10%，FBS终浓度为90%，而细胞密度则落在每毫升0.5 × 10⁶至10 × 10⁶个细胞的区间内。混匀后应立即分装，每支冻存管分装1毫升细胞悬液。

关于冻存密度，不同实验目的可能适合不同的细胞浓度。建议初次处理某类样本时，可以尝试设置几个密度梯度进行平行冻存，后续通过复苏检测来评估哪种浓度在活率、回收率和功能活性方面表现较佳——这一优化思路在后续使用FiniGet 分必得®试剂盒进行免疫磁珠分选时同样适用，因为起始细胞密度可能影响磁珠标记效率和分选纯度。

三、梯度降温与液氮长期保存

分装完成后，需要尽快将冻存管转移至梯度降温盒中，并放入-80°C冰箱过夜。梯度降温盒的作用是控制降温速率在每分钟约-1°C左右，避免冰晶形成对细胞造成不可逆损伤。需要特别注意的是，冻存液在室温下会快速升温并增加DMSO毒性，因此从混合、分装到放入降温盒的整个过程都应尽量紧凑，确保所有操作都在冰上或低温环境中完成，尽量缩短常温暴露时间。

经过-80°C过夜后，若需要长期保存，必须将冻存管转移至液氮。尽可能减少冻存管在室温环境中的暴露时间。虽然-80°C冰箱可用于短期存放，但长期保存会因温度波动导致细胞活率逐渐下降，因此不推荐将-80°C作为最终存储条件。